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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切总是切不开。。。有没有人用过NEB的NotI这个酶？
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
28楼: Originally posted by liuzhenhai at 2014-06-22 13:19:35
你是个新手吧。做酶切，没什么技术含量，只要注意操作，按说明就是。至于分别单切，只要buffer和酶活性考虑周全就是。

是新手
正在找原因，，，
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31楼2014-06-22 21:55:33
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
24楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-21 23:43:18
如果质粒加的太多的话，电泳结果应该能显示出两条带啊，一条切开的，一条没切开的。总不会因为加的质粒太对就让酶失活了吧...

切下来的片段有多大呀
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32楼2014-06-23 22:12:11
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a50044758

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
seven拂晓(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-25 13:32:18
NOT1还蛮好切的，你换个带NOT1的质粒切得看看，如果还是切不开那可能你的酶有问题，我以前遇到过这样的情况。
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33楼2014-06-24 09:58:15
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
32楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-06-23 22:12:11
切下来的片段有多大呀...

750bp
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34楼2014-06-25 12:09:19
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
34楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-25 12:09:19
750bp

这个不太好看啊  有点小   可以试着低电压  高浓度胶  时间20min看看有没有750的带
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35楼2014-06-25 14:54:39
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
35楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-06-25 14:54:39
这个不太好看啊  有点小   可以试着低电压  高浓度胶  时间20min看看有没有750的带...

我的片段和载体用同样的温度时间切 片段是可以切开的 载体就切不开
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36楼2014-06-27 08:58:13
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:23:19
1.“在一号管中加入酶切体系和NOTI酶，37度7个小时，电泳检测，发现酶切后的带和未酶切的带大小相同。说明酶切不成功。”

你的载体上只有一个NotI的酶切位点，搜易应该是线性化的，只有一条带，你提的质粒应该有2-3条带，如果切了以后只有一条带，就说明已经切开了。

2.“在二号管中加入酶切体系和sfiI酶，50度过夜。电泳检测，酶切后的带比未酶切的带迁移的慢，说明已经成功切开了。”
其实看酶切有没有完全的时候，这样做不太好。最好是比较提的质粒有2-3条带，酶切后的有1条带比较好。  
一般提质粒都有2-3条带的，试剂盒提质粒的话就不好说了，试剂盒提出来好像是一条带。
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37楼2014-06-27 10:40:20
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