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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切总是切不开。。。有没有人用过NEB的NotI这个酶？
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dongqin725

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
seven拂晓: 金币+5 2014-06-22 21:53:11
DoubleDigestionDesigner试试这个

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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21楼2014-06-21 18:04:02
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 雨雨催化剂 at 2014-06-21 09:02:07
Not1应该先构建在T载体上面，不然酶切效率非常低

恩恩 我就是先连的T载体 现在从T载体上切下来与其他的载体连的
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22楼2014-06-21 23:34:09
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 曾文正公 at 2014-06-21 11:37:06
你用的是notI还是NotI-HF  前者的话他们的buffer是不一样的  后者的话buffer倒是一样  不过我的经验是如果双酶切出了问题  用分开切一般就都解决了  仅供参考...

用的是not1-hf
你的意思是先用not1切，然后pcr回收，再用sfi切？
先用not1还是先用sfi有区别吗
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23楼2014-06-21 23:36:02
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-06-21 16:11:53
我感觉你的质粒加多了。   说明书里的都是1ug质粒用0.5ul的酶。
你加30ul，起码得有4ug以上。...

如果质粒加的太多的话，电泳结果应该能显示出两条带啊，一条切开的，一条没切开的。总不会因为加的质粒太对就让酶失活了吧
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24楼2014-06-21 23:43:18
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
seven拂晓(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-22 12:35:33
seven拂晓: 金币+10 2014-06-22 21:31:09
引用回帖:
9楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-20 21:52:18
那应该以什么标准来判断呢 1ul的酶切多少ul的载体呢...

看一微升是多少u，1u代表可以在一小时内切开一微克质粒的酶量。我以前也用你这个思路，费东西且低效。建议你用20微升体系加1到2微升的质粒（>100ng/μl），加0.5μl酶，肯定能切开且够用。
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25楼2014-06-22 01:21:21
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曾文正公

金虫 (著名写手)
★
seven拂晓(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-22 12:35:43
引用回帖:
23楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-21 23:36:02
用的是not1-hf
你的意思是先用not1切，然后pcr回收，再用sfi切？
先用not1还是先用sfi有区别吗...

都可以的  不过建议先用sfiI切  因为你质粒加的很多 而根据你之前的实验 这个酶不太可能有问题  然后再用notI切回收的产物(回收产物的量少)  这样更能消除不确定因素
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只有非常努力，才能看起来毫不费力
26楼2014-06-22 12:09:33
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liuzhenhai

铁杆木虫 (正式写手)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:22:54
NotI，好切啊。请您仔细阅读使用说明。另外，看看它们是否有连接酶活性，切开后可能连回去了。

[ 发自小木虫客户端 ]
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27楼2014-06-22 13:16:38
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liuzhenhai

铁杆木虫 (正式写手)
你是个新手吧。做酶切，没什么技术含量，只要注意操作，按说明就是。至于分别单切，只要buffer和酶活性考虑周全就是。

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28楼2014-06-22 13:19:35
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liuzhenhai

铁杆木虫 (正式写手)
注意酶是否失活！

[ 发自小木虫客户端 ]
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29楼2014-06-22 13:20:03
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 曾文正公 at 2014-06-22 12:09:33
都可以的  不过建议先用sfiI切  因为你质粒加的很多 而根据你之前的实验 这个酶不太可能有问题  然后再用notI切回收的产物(回收产物的量少)  这样更能消除不确定因素...

好 我这样做一下试试，十分感谢你呀
ps我很认同你的签名
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30楼2014-06-22 21:26:02
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