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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切总是切不开。。。有没有人用过NEB的NotI这个酶？
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切总是切不开。。。有没有人用过NEB的NotI这个酶？ 已有10人参与

各位同学
我这两个礼拜一只在用NOtI和sfiI这两个酶双酶切载体，但是一直都切不太出来。为了找出是哪个酶的问题，我是这样做的：
在一号管中加入酶切体系和NOTI酶，37度7个小时，电泳检测，发现酶切后的带和未酶切的带大小相同。说明酶切不成功。
在二号管中加入酶切体系和sfiI酶，50度过夜。电泳检测，酶切后的带比未酶切的带迁移的慢，说明已经成功切开了。

切片段的时候，是在以上同样的条件下（notI酶37度7个小时，再加sfiI酶50度过夜），电泳检测是正确的。
注：这两个酶用的都是NEB的，所用的buffer是一样的，都是一个叫cutsmart的buffer。说明书上写的是notI酶37度酶切15-20分钟，sfiI酶50度酶切15-20分钟。

各位高手知不知道这是怎么回事啊 急求帮助啊 这个NOTI贼贵贼贵的，用不起了！！！！！！！！！！！！
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1楼 2014-06-20 15:09:11
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曾文正公

金虫 (著名写手)
非常讨厌notI这个酶  建议换个酶切位点  用其他酶
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7楼2014-06-20 20:55:42
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曾文正公

金虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:21:54
引用回帖:
10楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-20 21:52:50
这个破载体不是商业化的就两个酶切位点。。。。...

这样的话只能分开切试试了  先用其中一个比如SFI先切开  做胶回收  再用NotI切回收产物  这样应该可以了
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12楼2014-06-20 22:47:07
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曾文正公

金虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:22:34
引用回帖:
14楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-20 23:43:51
这样分部做有什么意义呢 这两个酶的buffer一样啊...

你用的是notI还是NotI-HF  前者的话他们的buffer是不一样的  后者的话buffer倒是一样  不过我的经验是如果双酶切出了问题  用分开切一般就都解决了  仅供参考
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19楼2014-06-21 11:37:06
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曾文正公

金虫 (著名写手)
★
seven拂晓(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-22 12:35:43
引用回帖:
23楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-21 23:36:02
用的是not1-hf
你的意思是先用not1切，然后pcr回收，再用sfi切？
先用not1还是先用sfi有区别吗...

都可以的  不过建议先用sfiI切  因为你质粒加的很多 而根据你之前的实验 这个酶不太可能有问题  然后再用notI切回收的产物(回收产物的量少)  这样更能消除不确定因素
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只有非常努力，才能看起来毫不费力
26楼2014-06-22 12:09:33
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