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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于酶切位点ClaⅠ和NotⅠ的双酶切要怎么做？
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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)

[求助] 关于酶切位点ClaⅠ和NotⅠ的双酶切要怎么做？ 已有4人参与

因为载体上少的可怜的酶切位点，只能选择ClaⅠ和NotⅠ的位点，可是切出目的片段好困难啊……宝生物的酶和NEB的酶都用过了，还是切不出来，是什么问题呢？质粒已经换了N个了，突变也不能全部都突变了吧？酶也换过了？有什么好建议的体系吗？我在尝试一下！
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1楼 2014-01-04 09:00:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

李小坦儿

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
koreyoshitan: 金币+1, ★有帮助 2014-01-04 20:46:38
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-05 15:10:08
分步酶切损失会很大 每次胶回收都会损失50%左右吧
双酶切的同时应该用两个酶分别作单酶切 然后和原质粒 Marker 一起电泳 然后就可以看出来酶切效果了 哪个酶的酶切效率不高也一目了然了
你也可以换个试剂盒重新提质粒试试
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金戈铁马你要等我
4楼2014-01-04 19:11:30
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j2

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by koreyoshitan at 2014-01-04 10:49:49
不远，分开单酶切了，先CLAⅠ，回收后再用notⅠ的，可以么？...

离的不远的话双酶切不容易酶切完全，一样效率低损失大。效率低那个酶先切吧。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
6楼2014-01-05 08:49:33
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李小坦儿

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by koreyoshitan at 2014-01-04 20:46:17
嗯，明天尝试一下，如果其中有一个酶切效率不高，之后要怎么办呢？菜虫一只，请多多指教，谢谢...

要是有一个酶切效率不高的话 只能分步酶切了 我之前做酶切也是 分步酶切损失很多 我甚至一次切四个20微升的体系 但是后来我用别的同学的试剂盒提质粒 就可以完全切开了 所以说 你就得多尝试 希望对你能有帮助吧~
赞一下(2人) 回复此楼
金戈铁马你要等我
9楼2014-01-06 09:47:09
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j2

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
koreyoshitan: 金币+2, ★有帮助 2014-01-04 10:50:17
两个位点有多远？分开单酶切能切开吗
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
2楼2014-01-04 09:13:24
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ClaI和NotI这两个酶都还可以，都有用过，看下你的载体，确保ClaI的位点不在Dam甲基化位点内
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2014-01-05 15:26:53
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普通回帖

koreyoshitan

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by j2 at 2014-01-04 09:13:24
两个位点有多远？分开单酶切能切开吗

不远，分开单酶切了，先CLAⅠ，回收后再用notⅠ的，可以么？
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3楼2014-01-04 10:49:49
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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 李小坦儿 at 2014-01-04 19:11:30
分步酶切损失会很大 每次胶回收都会损失50%左右吧
双酶切的同时应该用两个酶分别作单酶切 然后和原质粒 Marker 一起电泳 然后就可以看出来酶切效果了 哪个酶的酶切效率不高也一目了然了
你也可以换个试剂盒重新 ...

嗯，明天尝试一下，如果其中有一个酶切效率不高，之后要怎么办呢？菜虫一只，请多多指教，谢谢
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5楼2014-01-04 20:46:17
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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by j2 at 2014-01-05 08:49:33
离的不远的话双酶切不容易酶切完全，一样效率低损失大。效率低那个酶先切吧。
...

嗯，我试试谢谢
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7楼2014-01-05 09:09:14
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koreyoshitan

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 李小坦儿 at 2014-01-06 09:47:09
要是有一个酶切效率不高的话 只能分步酶切了 我之前做酶切也是 分步酶切损失很多 我甚至一次切四个20微升的体系 但是后来我用别的同学的试剂盒提质粒 就可以完全切开了 所以说 你就得多尝试 希望对你能有帮助吧~
...

好的，只能尝试了
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10楼2014-01-06 14:52:55
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