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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切总是切不开。。。有没有人用过NEB的NotI这个酶？
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切总是切不开。。。有没有人用过NEB的NotI这个酶？ 已有10人参与

各位同学
我这两个礼拜一只在用NOtI和sfiI这两个酶双酶切载体，但是一直都切不太出来。为了找出是哪个酶的问题，我是这样做的：
在一号管中加入酶切体系和NOTI酶，37度7个小时，电泳检测，发现酶切后的带和未酶切的带大小相同。说明酶切不成功。
在二号管中加入酶切体系和sfiI酶，50度过夜。电泳检测，酶切后的带比未酶切的带迁移的慢，说明已经成功切开了。

切片段的时候，是在以上同样的条件下（notI酶37度7个小时，再加sfiI酶50度过夜），电泳检测是正确的。
注：这两个酶用的都是NEB的，所用的buffer是一样的，都是一个叫cutsmart的buffer。说明书上写的是notI酶37度酶切15-20分钟，sfiI酶50度酶切15-20分钟。

各位高手知不知道这是怎么回事啊 急求帮助啊 这个NOTI贼贵贼贵的，用不起了！！！！！！！！！！！！
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1楼 2014-06-20 15:09:11
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曾文正公

金虫 (著名写手)
★
seven拂晓(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-22 12:35:43
引用回帖:
23楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-21 23:36:02
用的是not1-hf
你的意思是先用not1切，然后pcr回收，再用sfi切？
先用not1还是先用sfi有区别吗...

都可以的  不过建议先用sfiI切  因为你质粒加的很多 而根据你之前的实验 这个酶不太可能有问题  然后再用notI切回收的产物(回收产物的量少)  这样更能消除不确定因素
赞一下(1人) 回复此楼
只有非常努力，才能看起来毫不费力
26楼2014-06-22 12:09:33
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
seven拂晓: 金币+5 2014-06-20 16:11:06
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-21 00:55:51
seven拂晓: 金币+5 2014-06-21 23:40:08
NOTI酶按理说挺好切的啊，TAKARA的就很好切。你的1ug质粒加了多少酶？试试多加一点切切看。
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2楼2014-06-20 15:30:51
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-06-20 15:30:51
NOTI酶按理说挺好切的啊，TAKARA的就很好切。你的1ug质粒加了多少酶？试试多加一点切切看。

我没有测质粒浓度，50ul的体系加了1ul的酶，30ul的质粒，质粒是比较多，可是总得有一部分切开的吧。电泳显示就一条单一的带
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3楼2014-06-20 15:36:43
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554526385

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
seven拂晓: 金币+5 2014-06-20 16:10:05
seven拂晓: 金币+10 2014-06-21 23:39:30
NOtI 的酶切效果受CG methylase导致的DNA甲基化的影响，严重影响
赞一下(2人) 回复此楼
我存在
4楼2014-06-20 15:50:08
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