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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切总是切不开。。。有没有人用过NEB的NotI这个酶？
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by syx1983 at 2014-06-20 21:21:44
分步切试试，not1贵呀，要珍惜。

是呀 贵的我都不敢做了 肉疼。。。。
我是用not1切完还没用sfi1切  就跑电泳看了 就是切不开啊
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11楼2014-06-20 21:54:41
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曾文正公

金虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:21:54
引用回帖:
10楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-20 21:52:50
这个破载体不是商业化的就两个酶切位点。。。。...

这样的话只能分开切试试了  先用其中一个比如SFI先切开  做胶回收  再用NotI切回收产物  这样应该可以了
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只有非常努力，才能看起来毫不费力
12楼2014-06-20 22:47:07
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cm8002

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
seven拂晓: 金币+10, ★有帮助 2014-06-20 23:44:25
seven拂晓: 金币+2 2014-06-22 21:45:20
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:22:03
建议先将载体测序看看，确定位点正确，Not1并没有那么难用吧

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13楼2014-06-20 23:16:07
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 曾文正公 at 2014-06-20 22:47:07
这样的话只能分开切试试了  先用其中一个比如SFI先切开  做胶回收  再用NotI切回收产物  这样应该可以了...

这样分部做有什么意义呢 这两个酶的buffer一样啊
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14楼2014-06-20 23:43:51
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by cm8002 at 2014-06-20 23:16:07
建议先将载体测序看看，确定位点正确，Not1并没有那么难用吧

有道理
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15楼2014-06-20 23:44:10
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952038213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-21 00:56:27
我之前用过NOTI，不过是takara的，不用切那么久吧，我最多切两个小时，效果挺好的

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16楼2014-06-21 00:19:09
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554526385

铜虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:22:18
引用回帖:
5楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-20 16:10:51
不太懂甲基化，刚才百度了下，还是不太明白，请问质粒也会甲基化吗...

为什么不会呢，会受到大肠杆菌甲基化酶的影响。在site-mute
实验中，就会用Dpn1来区别PCR得到的质粒（未甲基化）和提取质粒（甲基化）。
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我存在
17楼2014-06-21 08:49:28
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雨雨催化剂

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
seven拂晓: 金币+5 2014-06-21 23:37:41
Not1应该先构建在T载体上面，不然酶切效率非常低

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18楼2014-06-21 09:02:07
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曾文正公

金虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:22:34
引用回帖:
14楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-20 23:43:51
这样分部做有什么意义呢 这两个酶的buffer一样啊...

你用的是notI还是NotI-HF  前者的话他们的buffer是不一样的  后者的话buffer倒是一样  不过我的经验是如果双酶切出了问题  用分开切一般就都解决了  仅供参考
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只有非常努力，才能看起来毫不费力
19楼2014-06-21 11:37:06
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-20 15:36:43
我没有测质粒浓度，50ul的体系加了1ul的酶，30ul的质粒，质粒是比较多，可是总得有一部分切开的吧。电泳显示就一条单一的带...

我感觉你的质粒加多了。   说明书里的都是1ug质粒用0.5ul的酶。
你加30ul，起码得有4ug以上。
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20楼2014-06-21 16:11:53
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