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双酶切总是切不开。。。有没有人用过NEB的NotI这个酶？ 已有10人参与
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各位同学 我这两个礼拜一只在用NOtI和sfiI这两个酶双酶切载体，但是一直都切不太出来。为了找出是哪个酶的问题，我是这样做的： 在一号管中加入酶切体系和NOTI酶，37度7个小时，电泳检测，发现酶切后的带和未酶切的带大小相同。说明酶切不成功。 在二号管中加入酶切体系和sfiI酶，50度过夜。电泳检测，酶切后的带比未酶切的带迁移的慢，说明已经成功切开了。 切片段的时候，是在以上同样的条件下（notI酶37度7个小时，再加sfiI酶50度过夜），电泳检测是正确的。 注：这两个酶用的都是NEB的，所用的buffer是一样的，都是一个叫cutsmart的buffer。说明书上写的是notI酶37度酶切15-20分钟，sfiI酶50度酶切15-20分钟。 各位高手知不知道这是怎么回事啊 急求帮助啊 这个NOTI贼贵贼贵的，用不起了！！！！！！！！！！！！ |
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gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:23:19
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1.“在一号管中加入酶切体系和NOTI酶，37度7个小时，电泳检测，发现酶切后的带和未酶切的带大小相同。说明酶切不成功。” 你的载体上只有一个NotI的酶切位点，搜易应该是线性化的，只有一条带，你提的质粒应该有2-3条带，如果切了以后只有一条带，就说明已经切开了。 2.“在二号管中加入酶切体系和sfiI酶，50度过夜。电泳检测，酶切后的带比未酶切的带迁移的慢，说明已经成功切开了。” 其实看酶切有没有完全的时候，这样做不太好。最好是比较提的质粒有2-3条带，酶切后的有1条带比较好。 一般提质粒都有2-3条带的，试剂盒提质粒的话就不好说了，试剂盒提出来好像是一条带。 |
37楼2014-06-27 10:40:20
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