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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 眼含热泪求助：pcDNA3.1 插入4000bp 质粒构建，大虾请留步
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15944682692

新虫 (初入文坛)

[求助] 眼含热泪求助：pcDNA3.1 插入4000bp 质粒构建，大虾请留步 已有2人参与

各位大虾，兄弟最近忙于质粒构建，意图将一段长约4000+ bp的片段，通过Not1和EcoR1两个酶切位点连接到pcDNA3.1+载体上。情况如下：
1. 通过inversion AccuPrimeTaq DNA Polymerase High Fidelity酶扩增，并纯化回收目的片段（引物加酶切位点，保护性碱基，T7启动子）；由于回收效率很高150ng/ul，下一步双酶切时，NEB双酶切50ul体系，加了7 μl的目的片段*5，22℃12h,再进行胶回收。
2. 载体pcDNA3.1也按照以上的体系进行双酶切，时间为12 h,这次没有去磷酸化，（之前有过，也没连上）。
3. 将酶切后的目的片段和载体进行电泳，结果显示大小与预期相符，亮度相近。
4. 连接时，NEB T4连接酶，目的片段：载体=5：1，10 μl体系。
5. 感受态为新买的天根的DH5α。
结果：
转化后，平板上均有数量不等的菌落产生，少时10个，多时50来个。摇菌扩增8 h，提取质粒，检测组无阳性结果，有的在1000 bp左右出现条带，有的在鱼对照未酶切pCDNA3.1质粒相同位置2500左右出现条带。实验三个月无进展。
请高手指点迷津。
如果有效果好的、适于长片段连接的方法，也请大家指教，多谢。
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1楼 2014-02-25 08:30:03
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 可考虑将PCR产物连接到T vector，这样减少你PCR的次数。日后摇菌可扩增，还可以看到酶切干净的条带，不必担心PCR产物酶切不完全。
2. 连接之前，载体少加一些，外源基因可多加，比例可10:1~15:1。体系可扩大到15ul左右。
3.可连接16° 8h左右或者室温连接3h。
4. 如果成功率不高，可挑12-24个菌提取质粒鉴定。

祝好！本人最近也遇到难题，慢慢攻克中。加油啊！
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2楼2014-02-25 08:38:13
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15944682692

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-02-25 08:38:13
1. 可考虑将PCR产物连接到T vector，这样减少你PCR的次数。日后摇菌可扩增，还可以看到酶切干净的条带，不必担心PCR产物酶切不完全。
2. 连接之前，载体少加一些，外源基因可多加，比例可10:1~15:1。体系可扩大到1 ...

非常感谢您的回复，我也尝试过连接Ｔ载体，试过很多次，但都没成功，是不是因为片段太大了连不上呢，T：1ul,片段：4ul,solutionI：5ul。16℃过夜，一般都是自连，没连上过，您还有什么好建议吗？
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3楼2014-02-25 09:10:01
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 15944682692 at 2014-02-25 09:10:01
非常感谢您的回复，我也尝试过连接Ｔ载体，试过很多次，但都没成功，是不是因为片段太大了连不上呢，T：1ul,片段：4ul,solutionI：5ul。16℃过夜，一般都是自连，没连上过，您还有什么好建议吗？...

如果是自连的情况多，可以考虑在连接之前进行脱磷处理。也可以尝试转化过程中的慢摇在28°左右进行，后续培养菌也在28°左右。
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4楼2014-02-25 09:50:46
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 15944682692 at 2014-02-25 09:10:01
非常感谢您的回复，我也尝试过连接Ｔ载体，试过很多次，但都没成功，是不是因为片段太大了连不上呢，T：1ul,片段：4ul,solutionI：5ul。16℃过夜，一般都是自连，没连上过，您还有什么好建议吗？...

这步不加T4酶能连上吗
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5楼2014-02-25 10:01:23
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15944682692

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-02-25 10:01:23
这步不加T4酶能连上吗...

TAKARA的盒子，用的solutionI
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6楼2014-02-25 10:15:04
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ifyousee

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个首先如果是酶切后的黏性末端连接效率非常高的。
你这个实验流程安排的真不算多效率，还有很大的改进的空间。最简单的，我们实验室是挑取单克隆稀释于10uL灭菌水中（超净台操作），然后取2uL菌体稀释液直接作为PCR模板，另外8uL加入1mL的含抗性的LB培养液直接EP管摇上就可以了。然后PCR结果出来，菌液差不多摇出来了，看电泳图分装菌液、冻存、送测序~~OK，等结果
看你纠结这么久，我的Q是429108796，一直解决不了问题的话加我Q详谈吧。这个做分子实验不可避免的涉及非常多的药品试剂的厂家，说这个会被小木虫和谐的，所以~~
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7楼2014-02-25 13:05:09
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