应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 眼含热泪求助：pcDNA3.1 插入4000bp 质粒构建，大虾请留步
71/1返回列表
查看: 3043  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

15944682692

新虫 (初入文坛)

[求助] 眼含热泪求助：pcDNA3.1 插入4000bp 质粒构建，大虾请留步 已有2人参与

各位大虾，兄弟最近忙于质粒构建，意图将一段长约4000+ bp的片段，通过Not1和EcoR1两个酶切位点连接到pcDNA3.1+载体上。情况如下：
1. 通过inversion AccuPrimeTaq DNA Polymerase High Fidelity酶扩增，并纯化回收目的片段（引物加酶切位点，保护性碱基，T7启动子）；由于回收效率很高150ng/ul，下一步双酶切时，NEB双酶切50ul体系，加了7 μl的目的片段*5，22℃12h,再进行胶回收。
2. 载体pcDNA3.1也按照以上的体系进行双酶切，时间为12 h,这次没有去磷酸化，（之前有过，也没连上）。
3. 将酶切后的目的片段和载体进行电泳，结果显示大小与预期相符，亮度相近。
4. 连接时，NEB T4连接酶，目的片段：载体=5：1，10 μl体系。
5. 感受态为新买的天根的DH5α。
结果：
转化后，平板上均有数量不等的菌落产生，少时10个，多时50来个。摇菌扩增8 h，提取质粒，检测组无阳性结果，有的在1000 bp左右出现条带，有的在鱼对照未酶切pCDNA3.1质粒相同位置2500左右出现条带。实验三个月无进展。
请高手指点迷津。
如果有效果好的、适于长片段连接的方法，也请大家指教，多谢。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2014-02-25 08:30:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiyiyaya

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 可考虑将PCR产物连接到T vector，这样减少你PCR的次数。日后摇菌可扩增，还可以看到酶切干净的条带，不必担心PCR产物酶切不完全。
2. 连接之前，载体少加一些，外源基因可多加，比例可10:1~15:1。体系可扩大到15ul左右。
3.可连接16° 8h左右或者室温连接3h。
4. 如果成功率不高，可挑12-24个菌提取质粒鉴定。

祝好！本人最近也遇到难题，慢慢攻克中。加油啊！
赞一下 回复此楼
2楼2014-02-25 08:38:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

15944682692

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-02-25 08:38:13
1. 可考虑将PCR产物连接到T vector，这样减少你PCR的次数。日后摇菌可扩增，还可以看到酶切干净的条带，不必担心PCR产物酶切不完全。
2. 连接之前，载体少加一些，外源基因可多加，比例可10:1~15:1。体系可扩大到1 ...

非常感谢您的回复，我也尝试过连接Ｔ载体，试过很多次，但都没成功，是不是因为片段太大了连不上呢，T：1ul,片段：4ul,solutionI：5ul。16℃过夜，一般都是自连，没连上过，您还有什么好建议吗？
赞一下 回复此楼
3楼2014-02-25 09:10:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 15944682692 at 2014-02-25 09:10:01
非常感谢您的回复，我也尝试过连接Ｔ载体，试过很多次，但都没成功，是不是因为片段太大了连不上呢，T：1ul,片段：4ul,solutionI：5ul。16℃过夜，一般都是自连，没连上过，您还有什么好建议吗？...

如果是自连的情况多，可以考虑在连接之前进行脱磷处理。也可以尝试转化过程中的慢摇在28°左右进行，后续培养菌也在28°左右。
赞一下 回复此楼
4楼2014-02-25 09:50:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 15944682692 at 2014-02-25 09:10:01
非常感谢您的回复，我也尝试过连接Ｔ载体，试过很多次，但都没成功，是不是因为片段太大了连不上呢，T：1ul,片段：4ul,solutionI：5ul。16℃过夜，一般都是自连，没连上过，您还有什么好建议吗？...

这步不加T4酶能连上吗
赞一下 回复此楼
5楼2014-02-25 10:01:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

15944682692

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-02-25 10:01:23
这步不加T4酶能连上吗...

TAKARA的盒子，用的solutionI
赞一下 回复此楼
6楼2014-02-25 10:15:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ifyousee

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个首先如果是酶切后的黏性末端连接效率非常高的。
你这个实验流程安排的真不算多效率，还有很大的改进的空间。最简单的，我们实验室是挑取单克隆稀释于10uL灭菌水中（超净台操作），然后取2uL菌体稀释液直接作为PCR模板，另外8uL加入1mL的含抗性的LB培养液直接EP管摇上就可以了。然后PCR结果出来，菌液差不多摇出来了，看电泳图分装菌液、冻存、送测序~~OK，等结果
看你纠结这么久，我的Q是429108796，一直解决不了问题的话加我Q详谈吧。这个做分子实验不可避免的涉及非常多的药品试剂的厂家，说这个会被小木虫和谐的，所以~~
赞一下 回复此楼
7楼2014-02-25 13:05:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 15944682692 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿福大288有机化学，求调剂 +3 小木虫200408204 2026-03-18 3/150 2026-03-19 13:31 by houyaoxu
[考研] 085600材料与化工调剂 324分 +10 llllkkkhh 2026-03-18 10/500 2026-03-19 13:23 by houyaoxu
[考研] 287求调剂 +3 晨昏线与星海 2026-03-19 4/200 2026-03-19 12:32 by peike
[考研] 一志愿武汉理工材料工程专硕调剂 +3 Doleres 2026-03-19 3/150 2026-03-19 12:29 by peike
[考研] 材料考研调剂 +3 xwt。 2026-03-19 3/150 2026-03-19 11:22 by w沐阳w
[考研] 331求调剂（0703有机化学 +7 ZY-05 2026-03-13 8/400 2026-03-18 14:13 by 007_lilei
[考研] 302求调剂 +10 呼呼呼。。。。 2026-03-17 10/500 2026-03-18 12:45 by Linda Hu
[考研] 材料，纺织，生物（0856、0710），化学招生啦 +3 Eember. 2026-03-17 9/450 2026-03-18 10:28 by Eember.
[考研] 268求调剂 +6 简单点0 2026-03-17 6/300 2026-03-18 09:04 by 无际的草原
[考研] 296求调剂 +5 大口吃饭 身体健 2026-03-13 5/250 2026-03-17 21:05 by 不惑可乐
[考研] 梁成伟老师课题组欢迎你的加入 +8 一鸭鸭哟 2026-03-14 10/500 2026-03-17 15:07 by 一鸭鸭哟
[基金申请] 今年的国基金是打分制吗？ 50+3 zhanghaozhu 2026-03-14 3/150 2026-03-16 17:07 by 北京莱茵润色
[考研] 070305求调剂 +3 mlpqaz03 2026-03-14 4/200 2026-03-15 11:04 by peike
[考研] 294求调剂 +3 Zys010410@ 2026-03-13 4/200 2026-03-15 10:59 by zhq0425
[考研] 328求调剂 +3 5201314Lsy！ 2026-03-13 6/300 2026-03-14 15:31 by hyswxzs
[考研] 材料工程调剂 +9 咪咪空空 2026-03-12 9/450 2026-03-13 22:05 by 星空星月
[考研] 295求调剂 +3 小匕仔汁 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:17 by vgtyfty
[考研] 328化工专硕求调剂 +4 。，。，。，。i 2026-03-12 4/200 2026-03-13 14:44 by JourneyLucky
[考研] 085600材料与化工 309分请求调剂 +7 dtdxzxx 2026-03-12 8/400 2026-03-13 14:43 by jxchenghu
[考研] 289求调剂 +3 李政莹 2026-03-12 3/150 2026-03-13 11:02 by 求调剂zz
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭