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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一个关于酶切后质粒载体构建的问题
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三蛰

铜虫 (小有名气)

[求助] 一个关于酶切后质粒载体构建的问题 已有3人参与

最近在将一个两段带有酶切位点（如a，b）的目的片段通过双酶切后，连接到同样双酶切（a，b）的质粒载体的多克隆位点上。问题在于，每次目的片段的浓度很大，但酶切时体系中用的量很少，比如20ul只用2ul，导致最终酶切成功后无法纯化出浓度适合下一步连接实验的产物，请各位指导一下。解决办法是同比例放大酶切体系？还是什么别的方法？谢谢！
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我不会！
1楼 2014-01-20 18:59:06
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
三蛰: 金币+10, ★有帮助 2014-01-21 08:31:02
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-01-21 09:28:04
ab酶可同时用的话，载体、片段都回收以后，可以都切2ug,再直接加1.5V体积的DE-B过柱回收，估量，连接。
ab不能同时用，可以切3ug，酶要一个一个切。然后过柱回收，估量，连接。

连接时按那个公式计算加多少体积的载体和片段，片段可以稍多一点比较好。
连接时载体、片段每个几十ng就够用。
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2楼2014-01-20 21:16:29
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-21 09:28:08
可以放大酶切体系，我们这都是50ul酶切体系。你目的片段酶切后可以过回收柱纯化，质量会高些。
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hehe
3楼2014-01-20 21:44:30
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-01-21 09:28:12
连接反应通常用的DNA都很少，酶切1-2μg质粒是足够的。通常的回收试剂盒回收后的浓度有几十ng/μl，做几次连接反应都够的。如果你回收效率非常差，一般是回收盒子出了问题。如果你实在需要大量连接，可以按照比例扩大酶切体系。
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4楼2014-01-21 02:56:52
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三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-01-20 21:16:29
ab酶可同时用的话，载体、片段都回收以后，可以都切2ug,再直接加1.5V体积的DE-B过柱回收，估量，连接。
ab不能同时用，可以切3ug，酶要一个一个切。然后过柱回收，估量，连接。

连接时按那个公式计算加多少体积 ...

好像目的片段最好上50ng才中……好吧，就这样吧。没有捷径就脚踏实地，吼吼
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我不会！
5楼2014-01-21 08:30:46
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-01-21 08:30:46
好像目的片段最好上50ng才中……好吧，就这样吧。没有捷径就脚踏实地，吼吼...

恩。
6楼2014-01-21 08:42:47
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我的天堂

木虫 (小有名气)
两个酶 分别切 中间做纯化 不做回收 酶切完再做纯化，然后直接连接
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Healtheworld.
7楼2014-01-21 10:14:30
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