应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一个关于酶切后质粒载体构建的问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
71/1返回列表
查看: 1851  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

三蛰

铜虫 (小有名气)

[求助] 一个关于酶切后质粒载体构建的问题 已有3人参与

最近在将一个两段带有酶切位点（如a，b）的目的片段通过双酶切后，连接到同样双酶切（a，b）的质粒载体的多克隆位点上。问题在于，每次目的片段的浓度很大，但酶切时体系中用的量很少，比如20ul只用2ul，导致最终酶切成功后无法纯化出浓度适合下一步连接实验的产物，请各位指导一下。解决办法是同比例放大酶切体系？还是什么别的方法？谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
我不会！
1楼 2014-01-20 18:59:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
三蛰: 金币+10, ★有帮助 2014-01-21 08:31:02
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-01-21 09:28:04
ab酶可同时用的话，载体、片段都回收以后，可以都切2ug,再直接加1.5V体积的DE-B过柱回收，估量，连接。
ab不能同时用，可以切3ug，酶要一个一个切。然后过柱回收，估量，连接。

连接时按那个公式计算加多少体积的载体和片段，片段可以稍多一点比较好。
连接时载体、片段每个几十ng就够用。
赞一下 回复此楼
2楼2014-01-20 21:16:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-21 09:28:08
可以放大酶切体系，我们这都是50ul酶切体系。你目的片段酶切后可以过回收柱纯化，质量会高些。
赞一下 回复此楼
hehe
3楼2014-01-20 21:44:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-01-21 09:28:12
连接反应通常用的DNA都很少，酶切1-2μg质粒是足够的。通常的回收试剂盒回收后的浓度有几十ng/μl，做几次连接反应都够的。如果你回收效率非常差，一般是回收盒子出了问题。如果你实在需要大量连接，可以按照比例扩大酶切体系。
赞一下 回复此楼
4楼2014-01-21 02:56:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-01-20 21:16:29
ab酶可同时用的话，载体、片段都回收以后，可以都切2ug,再直接加1.5V体积的DE-B过柱回收，估量，连接。
ab不能同时用，可以切3ug，酶要一个一个切。然后过柱回收，估量，连接。

连接时按那个公式计算加多少体积 ...

好像目的片段最好上50ng才中……好吧，就这样吧。没有捷径就脚踏实地，吼吼
赞一下 回复此楼
我不会！
5楼2014-01-21 08:30:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-01-21 08:30:46
好像目的片段最好上50ng才中……好吧，就这样吧。没有捷径就脚踏实地，吼吼...

恩。
6楼2014-01-21 08:42:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我的天堂

木虫 (小有名气)
两个酶 分别切 中间做纯化 不做回收 酶切完再做纯化，然后直接连接
赞一下 回复此楼
Healtheworld.
7楼2014-01-21 10:14:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 三蛰 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 302分求调剂 一志愿安徽大学085601 +8 zyx上岸！ 2026-04-04 8/400 2026-04-05 23:08 by lbsjt
[考研] 316求调剂 +5 yyx想调剂 2026-04-05 5/250 2026-04-05 22:22 by 咔咔咔咔9
[考研] 348求调剂 +3 车厘子zzz 2026-04-05 3/150 2026-04-05 20:30 by 啵啵啵0119
[考研] 调剂 +3 李广火 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:57 by 蓝云思雨
[考研] 0703化学调剂325分 +9 15771691647 2026-04-04 9/450 2026-04-05 11:39 by 猪会飞
[考研] 材料调剂 +7 dxy调剂 2026-04-04 7/350 2026-04-05 09:15 by 陌秋26
[考研] 085400电子信息319求调剂（接受跨专业调剂） +5 星星不眨眼喽 2026-04-03 6/300 2026-04-04 21:50 by hemengdong
[考研] 调剂 +4 是可乐不是可乐 2026-04-04 4/200 2026-04-04 19:41 by 唐沐儿
[考研] 一志愿085404，总分291，四级已过，求调剂 +5 阿俊阿俊阿俊 2026-04-04 7/350 2026-04-04 13:23 by 莲菜就是藕吧
[考研] 化工求调剂 +11 荔香芝士椰奶 2026-04-03 11/550 2026-04-03 22:06 by 啵啵啵0119
[考研] 288求调剂 一志愿哈工大 材料与化工 +39 洛神哥哥 2026-03-31 41/2050 2026-04-03 21:51 by qlm5820
[考研] 建环，能源，土木老师路过看一看！！！ +5 嘿嘿uu 2026-04-01 5/250 2026-04-03 11:47 by znian
[考研] 0703化学 +7 goldtt 2026-04-02 9/450 2026-04-03 09:36 by 蓝云思雨
[考研] 295求调剂 +7 愿旅途永远坦然 2026-04-02 7/350 2026-04-03 08:22 by fangshan711
[考研] 318求调剂 +3 笃行致远. 2026-03-31 4/200 2026-04-02 15:56 by Jaylen.
[考研] 材料化工340求调剂 +5 jhx777 2026-03-30 5/250 2026-04-02 12:45 by smileboy2006
[考研] 求调剂推荐 +3 南山南@ 2026-04-01 3/150 2026-04-02 12:09 by xiaoranmu
[考研] 272求调剂，接受跨专业调剂！ +4 闲鱼卢 2026-03-31 4/200 2026-04-02 11:18 by guyan1000
[考研] 一志愿中海洋材料357 +4 麦恩莉. 2026-03-30 4/200 2026-03-31 14:35 by 记事本2026
[考研] 哈尔滨工业大学材料与化工专硕378求调剂 +3 塔比乌斯 2026-03-30 3/150 2026-03-30 22:55 by 无际的草原
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭