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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 质粒提取后进行双酶切无目的基因
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wlc0206

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒提取后进行双酶切无目的基因 已有6人参与

各位大神，我是新虫，悬赏金币就一个，跪求各位帮忙。今天提取质粒之后进行了双酶切，第一组（左上三列）目的基因是1050bp，T载体没问题，为最上面的条带，但不知道为什么下面出现了两条条带，而且和目的基因的bp不符合。另外右上的一组也出现了问题，T载体有，目的基因是1071bp，但也是没有目的基因出现多条条带。后面试了次单酶切也是出现了多条带，没有目的基因。单独跑的质粒是没问题的。究竟原因是出在了哪里啊，求助啊！

质粒提取后进行双酶切无目的基因
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1楼 2014-07-19 20:57:42
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-07-20 10:35:28
gyesang: 应助指数+1 2014-07-22 18:18:49
你能不能把你的Marker那几条带对应的大小给说清楚？
以下是几点建议。
1.以质粒为模板以你扩基因的引物PCR验证。看扩增大小是否与你的预期一致
2.如果上一步正确而且双酶切的片段比你的基因小，更可能是你的基因中本身就有你内切酶的识别位点导致多点切割。
3.如果单酶切和双酶切有大于你的基因而小于T载体的条带，再排除了T载体本身是否有额外切割位点后那就是你酶切的问题，可能是酶切体系条件不合理导致的star活性，也可能是内切酶本身储存不合理或者放置时间太长导致的非特异性切割。
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大家相互帮助哈
3楼2014-07-19 22:10:00
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普通回帖

hajierlove

铜虫 (正式写手)
★
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是不是酶加多了，乱切，质粒浓度测了吗
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踏实
2楼2014-07-19 22:05:03
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xzy0425

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-19 22:10:00
你能不能把你的Marker那几条带对应的大小给说清楚？
以下是几点建议。
1.以质粒为模板以你扩基因的引物PCR验证。看扩增大小是否与你的预期一致
2.如果上一步正确而且双酶切的片段比你的基因小，更可能是你的基因 ...

我想请问一下：你的建议第一条的PCR扩增产物是什么？模板质粒扩增之前需做什么处理？
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4楼2014-07-20 07:52:25
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wlc0206

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-19 22:10:00
你能不能把你的Marker那几条带对应的大小给说清楚？
以下是几点建议。
1.以质粒为模板以你扩基因的引物PCR验证。看扩增大小是否与你的预期一致
2.如果上一步正确而且双酶切的片段比你的基因小，更可能是你的基因 ...

Marker条带大小：8000.4000.2500.1500.1000.500
已经找到原因了，T载体大小符合，是目的基因里面含有酶切位点，请问下有什么补救方法吗？谢谢。
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5楼2014-07-20 10:52:12
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wlc0206

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hajierlove at 2014-07-19 22:05:03
是不是酶加多了，乱切，质粒浓度测了吗

酶切体系没有问题，是目的基因上面含有酶切位点了。
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6楼2014-07-20 10:53:37
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★
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4楼: Originally posted by xzy0425 at 2014-07-20 07:52:25
我想请问一下：你的建议第一条的PCR扩增产物是什么？模板质粒扩增之前需做什么处理？...

扩增产物当然是你的基因，大小与你连T载体前PCR扩增的大小一致
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大家相互帮助哈
7楼2014-07-20 11:38:24
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by wlc0206 at 2014-07-20 10:52:12
Marker条带大小：8000.4000.2500.1500.1000.500
已经找到原因了，T载体大小符合，是目的基因里面含有酶切位点，请问下有什么补救方法吗？谢谢。...

重新设计带有合适酶切位点的引物，用你原先的模板重新PCR扩增
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8楼2014-07-20 11:42:09
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader
★
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5楼: Originally posted by wlc0206 at 2014-07-19 21:52:12
Marker条带大小：8000.4000.2500.1500.1000.500
已经找到原因了，T载体大小符合，是目的基因里面含有酶切位点，请问下有什么补救方法吗？谢谢。...

补救？是要拿到双酶切片段吗？若是，则：
先用单一酶切位点的酶进行单酶切，并保证完全酶切；再用第二个酶（有两个位点）进行限制性（limited）酶切，或者说部分酶切，分离后就有机会拿到你所需要的片段了。
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9楼2014-07-20 11:45:49
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wlc0206

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-20 11:42:09
重新设计带有合适酶切位点的引物，用你原先的模板重新PCR扩增...

嗯，也就是说只能重做了。谢谢。
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10楼2014-07-20 16:12:37
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