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jsxzzxj

铜虫 (初入文坛)

[求助] 如何获取目的质粒？

1.一个细菌里面有好几个质粒，用质粒提取试剂盒提出质粒，如何从这些质粒中获得携带有目的基因的质粒？求哪个大神指导一下
2.再弱弱的问一下如果以上提出的混合质粒，用PCR证实携带有目的基因，可以直接让测序公司质粒测序吗？
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1楼 2013-12-11 08:34:08
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zilinweizhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-11 09:59:38
我以前用的方法就是将提取的质粒再次转换，用抗生素多次筛选，直到获得纯的质粒；
混合质粒是不能测序的，不然有杂峰干扰，效果很差
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2楼2013-12-11 09:03:36
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屿iland

金虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-13 14:55:37
楼主这样不知可行不：先分离质粒（用电泳应该就可以办到），再胶回收（有试剂盒的），那么混合的质粒得到了分离，然后分别测试找到你要的目的基因的片段。

不知还有没有其他更好的方法，欢迎交流指正

祝楼主试验顺利
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3楼2013-12-11 10:24:52
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屿iland

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 屿iland at 2013-12-11 10:24:52
楼主这样不知可行不：先分离质粒（用电泳应该就可以办到），再胶回收（有试剂盒的），那么混合的质粒得到了分离，然后分别测试找到你要的目的基因的片段。

不知还有没有其他更好 ...

打错字了，是测序不是测试
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4楼2013-12-11 10:30:11
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jsxzzxj

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 屿iland at 2013-12-11 10:24:52
楼主这样不知可行不：先分离质粒（用电泳应该就可以办到），再胶回收（有试剂盒的），那么混合的质粒得到了分离，然后分别测试找到你要的目的基因的片段。

不知还有没有其他更好 ...

按照理论上这个应该可以的，不过我提出的质粒电泳大多数是三条条带，据说是一条是超螺旋的，一条是线性的，一条是环状的，那如果是这样怎么让质粒跑开呢？我是菜鸟，欢迎批评指正
   还有我的质粒marker是V517，按照道理能跑出7条条带，可我提出来的只有3条条带，为什么呀？
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5楼2013-12-12 08:44:16
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jsxzzxj

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zilinweizhu at 2013-12-11 09:03:36
我以前用的方法就是将提取的质粒再次转换，用抗生素多次筛选，直到获得纯的质粒；
混合质粒是不能测序的，不然有杂峰干扰，效果很差

一看就是大神级人物，那我继续请教几个问题奥：
1.你肯定做过质粒接合实验，我都奔波五个月啦得做了好几十次啦，但一直没有成功，我做的是肠杆菌科细菌KPC阳性的，用的结合受体菌是J53，按照道理这种接合应该是成功率很高的，我用的筛选药物是叠氮钠和美平，浓度时230ug/ml和2ug/ml，用的方法是将隔夜培养的细菌按4:1混合在血平板上培养一夜然后将混合菌接种在麦康凯筛选培养基上，培养结果是阴性。实在是找不到原因啦。大神可不可以把你做的详细步骤发给我看一下呢？万分感谢
2.你应该也做过质粒转化实验吧？你的感受态细菌室自己做的还是买的？我曾经自己做过一次结果没有成功，也不知道是质粒提取不成功还是感受态细菌没成功，我用的方法是钙转，不能进行电转，因为我们这边的实验设备太落后啦，求大神讲点心得奥
3.我提取质粒的电泳marker是V517，按理应该7条条带的，可是提了好几次啦，始终仅跑出3条条带，这是什么原因呢？
一下子提了这么多问题，都不好意思啦，大神可不要烦奥
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6楼2013-12-12 09:06:49
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屿iland

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jsxzzxj at 2013-12-12 08:44:16
按照理论上这个应该可以的，不过我提出的质粒电泳大多数是三条条带，据说是一条是超螺旋的，一条是线性的，一条是环状的，那如果是这样怎么让质粒跑开呢？我是菜鸟，欢迎批评指正
   还有我的质粒marker是V517，按 ...

胶的浓度对不对，是不是浓度太大没分开？

理论上，要想把质粒分开最好是酶切成线状最好了，可以先酶切开再跑

我也是菜鸟一枚
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7楼2013-12-13 12:47:06
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jsxzzxj

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 屿iland at 2013-12-13 12:47:06
胶的浓度对不对，是不是浓度太大没分开？

理论上，要想把质粒分开最好是酶切成线状最好了，可以先酶切开再跑

我也是菜鸟一枚...

那是单酶切还是双酶切呀？感谢交流呀
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8楼2013-12-14 08:49:52
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屿iland

金虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by jsxzzxj at 2013-12-14 08:49:52
那是单酶切还是双酶切呀？感谢交流呀...

酶切前，质粒电泳图一般是三条条带，这三条带从下到上一次是线性、环状、超螺旋。当然 从细菌中大量提取的质粒电泳时，不一定均出现三条带，有时会出现两条，甚至一条(一般是超螺旋的质粒)，这跟上样量也有些关系。出现不同的结果都是由抽提质粒时的操作手法造成的。如果严格按照操作步骤，超螺旋的质粒会较多。

单酶切后，超螺旋和环形质粒会变成开链DNA，开链的DNA在凝胶中泳动速度慢于超螺旋质粒且由于开链质粒量变多，此条带也会变大，如酶切充分，就只会看到一条带，但是由于你的多个质粒混到一起，会有多条带，如果不充分，就会有大小有差距的几条带。

双酶切后，且片段大小适中的话，可以看见酶切的片段和载体，还有未切开的质粒。

只有通过单酶切，使成一条带，与Marker比较才能鉴定大小。

通常所说的质粒大小，若不测序鉴定，通常指单酶切后线性化条带电泳时所处的位置（与Mark比较）。
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9楼2013-12-14 10:36:40
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