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如何获取目的质粒？
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1.一个细菌里面有好几个质粒，用质粒提取试剂盒提出质粒，如何从这些质粒中获得携带有目的基因的质粒？求哪个大神指导一下 2.再弱弱的问一下如果以上提出的混合质粒，用PCR证实携带有目的基因，可以直接让测序公司质粒测序吗？ |
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zilinweizhu
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- 专业: 微生物生理与生物化学
2楼2013-12-11 09:03:36
3楼2013-12-11 10:24:52
4楼2013-12-11 10:30:11
5楼2013-12-12 08:44:16
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一看就是大神级人物，那我继续请教几个问题奥： 1.你肯定做过质粒接合实验，我都奔波五个月啦得做了好几十次啦，但一直没有成功，我做的是肠杆菌科细菌KPC阳性的，用的结合受体菌是J53，按照道理这种接合应该是成功率很高的，我用的筛选药物是叠氮钠和美平，浓度时230ug/ml和2ug/ml，用的方法是将隔夜培养的细菌按4:1混合在血平板上培养一夜然后将混合菌接种在麦康凯筛选培养基上，培养结果是阴性。实在是找不到原因啦。大神可不可以把你做的详细步骤发给我看一下呢？万分感谢 2.你应该也做过质粒转化实验吧？你的感受态细菌室自己做的还是买的？我曾经自己做过一次结果没有成功，也不知道是质粒提取不成功还是感受态细菌没成功，我用的方法是钙转，不能进行电转，因为我们这边的实验设备太落后啦，求大神讲点心得奥 3.我提取质粒的电泳marker是V517，按理应该7条条带的，可是提了好几次啦，始终仅跑出3条条带，这是什么原因呢？ 一下子提了这么多问题，都不好意思啦，大神可不要烦奥   |
6楼2013-12-12 09:06:49
7楼2013-12-13 12:47:06
8楼2013-12-14 08:49:52
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酶切前，质粒电泳图一般是三条条带，这三条带从下到上一次是线性、环状、超螺旋。当然 从细菌中大量提取的质粒电泳时，不一定均出现三条带，有时会出现两条，甚至一条(一般是超螺旋的质粒)，这跟上样量也有些关系。出现不同的结果都是由抽提质粒时的操作手法造成的。如果严格按照操作步骤，超螺旋的质粒会较多。 单酶切后，超螺旋和环形质粒会变成开链DNA，开链的DNA在凝胶中泳动速度慢于超螺旋质粒且由于开链质粒量变多，此条带也会变大，如酶切充分，就只会看到一条带，但是由于你的多个质粒混到一起，会有多条带，如果不充分，就会有大小有差距的几条带。 双酶切后，且片段大小适中的话，可以看见酶切的片段和载体，还有未切开的质粒。 只有通过单酶切，使成一条带，与Marker比较才能鉴定大小。 通常所说的质粒大小，若不测序鉴定，通常指单酶切后线性化条带电泳时所处的位置（与Mark比较）。 |
9楼2013-12-14 10:36:40
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