应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 转化感受态后提取质粒，测浓度总是很低
181/1返回列表
查看: 6554  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

hua_geduo

木虫 (正式写手)

[交流] 转化感受态后提取质粒，测浓度总是很低

年前做表达，目的片段连接到T载体上，然后转化，挑菌，摇菌，提取质粒，测质粒浓度总是很低；现在我的表达载体量不够了，想转化后提取，使量大一点，但是发现提取后测浓度又遇到同样的状况，请问这是怎么回事啊？用的感受态是DH5α，提质粒的试剂盒是爱思进的，实验卡在这里了，急求帮助！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2013-03-19 09:48:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

玉米头

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励来分子生物版块发贴交流！ 2013-03-19 12:22:49
我也遇到过这种情况，质粒得率低，做了好多次都是这样，你可以换成JM109的，我试过，效果很好。这可能是DH5a不大适合T载体的扩增。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2013-03-19 10:31:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hua_geduo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 玉米头 at 2013-03-19 10:31:14
我也遇到过这种情况，质粒得率低，做了好多次都是这样，你可以换成JM109的，我试过，效果很好。这可能是DH5a不大适合T载体的扩增。

T载体克隆提质粒已经做完了，现在在做表达载体质粒的提取
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2013-03-19 11:50:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
6楼: Originally posted by hua_geduo at 2013-03-19 11:50:41
T载体克隆提质粒已经做完了，现在在做表达载体质粒的提取...

表达载体一般不如克隆载体的拷贝数高，提质粒一般浓度会小一些。你可以多摇些菌。裂解时的溶液按菌量增加，上column吸附的时候可以用同一个柱子，按常规方法elute就可以了。
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2013-03-19 13:16:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

潇潇溪

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我之前也有过这样的情况，也是T载体，后来我就把提出的质粒（虽然浓度低，但是还是有的情况下）化转一下，再挑取单菌落提质粒，就变浓了。你可以试一下，但是个中原因我还在找。希望能帮助到你。
赞一下(1人) 回复此楼
16楼2015-05-06 11:21:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

xuchenxi121

新虫 (初入文坛)
★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
通常不会是感受态的问题，而是提取质粒的问题，用试剂盒提取时很大可能会有质粒在柱子上洗脱不彻底的情况，因此建议可以将Elution加热后再洗脱，可显著提高得率。
赞一下 回复此楼
2楼2013-03-19 10:23:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 很好的建议，鼓励交流哈！ 2013-03-19 12:26:44
是先划板活化后再挑菌放大摇菌是吗？
我以前用DH5a做宿主培养提取质粒也没问题的。
会不会是你的质粒拷贝数比较低？试着用低拷贝的质粒抽提试剂盒看看会不会好一些？
赞一下 回复此楼
4楼2013-03-19 10:52:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hua_geduo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xuchenxi121 at 2013-03-19 10:23:41
通常不会是感受态的问题，而是提取质粒的问题，用试剂盒提取时很大可能会有质粒在柱子上洗脱不彻底的情况，因此建议可以将Elution加热后再洗脱，可显著提高得率。

好的，我试试，谢谢
回复此楼
5楼2013-03-19 11:49:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hua_geduo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sxxuan at 2013-03-19 10:52:35
是先划板活化后再挑菌放大摇菌是吗？
我以前用DH5a做宿主培养提取质粒也没问题的。
会不会是你的质粒拷贝数比较低？试着用低拷贝的质粒抽提试剂盒看看会不会好一些？

会不会是摇床的转速问题呢，我们的摇床坏过一次，修好后虽然现实转速是那么大，但总感觉没有那么快
赞一下 回复此楼
7楼2013-03-19 11:51:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)
★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
表达载体比如pET系列， pGEX系列，提取质粒，浓度不高很正常啊，因为他们不是克隆载体，他们的启动子是严谨型启动子，要想获得大量质粒，你可以做中抽或大抽质粒，而且你转化表达菌株也不需要那么大的质粒浓度，只要转化表达菌株长出克隆出来就可以了
赞一下 回复此楼
8楼2013-03-19 12:25:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hua_geduo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-19 13:16:45
表达载体一般不如克隆载体的拷贝数高，提质粒一般浓度会小一些。你可以多摇些菌。裂解时的溶液按菌量增加，上column吸附的时候可以用同一个柱子，按常规方法elute就可以了。...

原来摇了4ml的菌液提的质粒，效果还是不理想，我再试试吧，谢谢
赞一下 回复此楼
10楼2013-03-19 14:05:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hua_geduo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-19 12:25:36
表达载体比如pET系列， pGEX系列，提取质粒，浓度不高很正常啊，因为他们不是克隆载体，他们的启动子是严谨型启动子，要想获得大量质粒，你可以做中抽或大抽质粒，而且你转化表达菌株也不需要那么大的质粒浓度，只要 ...

嗯，知道了，谢谢
回复此楼
11楼2013-03-19 14:06:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huoyongting

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
同意楼上的，表达载体的拷贝数一般都是比较低的，你可以看下质粒图谱看看是什么ori ，但是T载体是高拷贝的，提的浓度低的话就不太正常了
赞一下 回复此楼
12楼2013-03-19 16:39:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by hua_geduo at 2013-03-19 14:05:46
原来摇了4ml的菌液提的质粒，效果还是不理想，我再试试吧，谢谢...

4ml菌液小提质粒不算很多，可以用10-20ml。
赞一下 回复此楼
13楼2013-03-20 03:07:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by hua_geduo at 2013-03-19 14:05:46
原来摇了4ml的菌液提的质粒，效果还是不理想，我再试试吧，谢谢...

4ml估计不够啊，9楼的见解和方法很好，有时候我会把菌液加到8ml，分成两管去裂解，然后都吸附到同一个柱子上。分部洗脱效率会高一些。
表达载体的质粒本来就不是很好提的。多尝试几次吧。如果是摇床有问题的话，你可以拿个温度计看看温度准不准，转速慢顶多就多摇几个小时摇到菌浓度够。
如果菌发青的话要考虑是不是死菌增多了
赞一下 回复此楼
14楼2013-03-20 12:06:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hua_geduo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by sxxuan at 2013-03-20 12:06:59
4ml估计不够啊，9楼的见解和方法很好，有时候我会把菌液加到8ml，分成两管去裂解，然后都吸附到同一个柱子上。分部洗脱效率会高一些。
表达载体的质粒本来就不是很好提的。多尝试几次吧。如果是摇床有问题的话，你 ...

嗯，好的，谢谢你的建议，我再试试
赞一下 回复此楼
15楼2013-03-21 09:26:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hua_geduo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 潇潇溪 at 2015-05-06 11:21:08
我之前也有过这样的情况，也是T载体，后来我就把提出的质粒（虽然浓度低，但是还是有的情况下）化转一下，再挑取单菌落提质粒，就变浓了。你可以试一下，但是个中原因我还在找。希望能帮助到你。

谢谢你的建议，但是。。。。我这帖子是2013年的……你懂的
赞一下 回复此楼
17楼2015-05-06 14:32:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
lcp_201418楼
2015-08-20 10:31   回复  
相关版块跳转 我要订阅楼主 hua_geduo 的主题更新
181/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭