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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 转化感受态后提取质粒，测浓度总是很低
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hua_geduo

木虫 (正式写手)

[交流] 转化感受态后提取质粒，测浓度总是很低

年前做表达，目的片段连接到T载体上，然后转化，挑菌，摇菌，提取质粒，测质粒浓度总是很低；现在我的表达载体量不够了，想转化后提取，使量大一点，但是发现提取后测浓度又遇到同样的状况，请问这是怎么回事啊？用的感受态是DH5α，提质粒的试剂盒是爱思进的，实验卡在这里了，急求帮助！
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1楼 2013-03-19 09:48:17
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玉米头

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励来分子生物版块发贴交流！ 2013-03-19 12:22:49
我也遇到过这种情况，质粒得率低，做了好多次都是这样，你可以换成JM109的，我试过，效果很好。这可能是DH5a不大适合T载体的扩增。
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3楼2013-03-19 10:31:14
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hua_geduo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 玉米头 at 2013-03-19 10:31:14
我也遇到过这种情况，质粒得率低，做了好多次都是这样，你可以换成JM109的，我试过，效果很好。这可能是DH5a不大适合T载体的扩增。

T载体克隆提质粒已经做完了，现在在做表达载体质粒的提取
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6楼2013-03-19 11:50:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
6楼: Originally posted by hua_geduo at 2013-03-19 11:50:41
T载体克隆提质粒已经做完了，现在在做表达载体质粒的提取...

表达载体一般不如克隆载体的拷贝数高，提质粒一般浓度会小一些。你可以多摇些菌。裂解时的溶液按菌量增加，上column吸附的时候可以用同一个柱子，按常规方法elute就可以了。
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9楼2013-03-19 13:16:45
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潇潇溪

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我之前也有过这样的情况，也是T载体，后来我就把提出的质粒（虽然浓度低，但是还是有的情况下）化转一下，再挑取单菌落提质粒，就变浓了。你可以试一下，但是个中原因我还在找。希望能帮助到你。
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16楼2015-05-06 11:21:08
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普通回帖

xuchenxi121

新虫 (初入文坛)
★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
通常不会是感受态的问题，而是提取质粒的问题，用试剂盒提取时很大可能会有质粒在柱子上洗脱不彻底的情况，因此建议可以将Elution加热后再洗脱，可显著提高得率。
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2楼2013-03-19 10:23:41
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 很好的建议，鼓励交流哈！ 2013-03-19 12:26:44
是先划板活化后再挑菌放大摇菌是吗？
我以前用DH5a做宿主培养提取质粒也没问题的。
会不会是你的质粒拷贝数比较低？试着用低拷贝的质粒抽提试剂盒看看会不会好一些？
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4楼2013-03-19 10:52:35
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hua_geduo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xuchenxi121 at 2013-03-19 10:23:41
通常不会是感受态的问题，而是提取质粒的问题，用试剂盒提取时很大可能会有质粒在柱子上洗脱不彻底的情况，因此建议可以将Elution加热后再洗脱，可显著提高得率。

好的，我试试，谢谢
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5楼2013-03-19 11:49:41
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hua_geduo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sxxuan at 2013-03-19 10:52:35
是先划板活化后再挑菌放大摇菌是吗？
我以前用DH5a做宿主培养提取质粒也没问题的。
会不会是你的质粒拷贝数比较低？试着用低拷贝的质粒抽提试剂盒看看会不会好一些？

会不会是摇床的转速问题呢，我们的摇床坏过一次，修好后虽然现实转速是那么大，但总感觉没有那么快
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7楼2013-03-19 11:51:48
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)
★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
表达载体比如pET系列， pGEX系列，提取质粒，浓度不高很正常啊，因为他们不是克隆载体，他们的启动子是严谨型启动子，要想获得大量质粒，你可以做中抽或大抽质粒，而且你转化表达菌株也不需要那么大的质粒浓度，只要转化表达菌株长出克隆出来就可以了
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8楼2013-03-19 12:25:36
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hua_geduo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-19 13:16:45
表达载体一般不如克隆载体的拷贝数高，提质粒一般浓度会小一些。你可以多摇些菌。裂解时的溶液按菌量增加，上column吸附的时候可以用同一个柱子，按常规方法elute就可以了。...

原来摇了4ml的菌液提的质粒，效果还是不理想，我再试试吧，谢谢
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10楼2013-03-19 14:05:46
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hua_geduo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-19 12:25:36
表达载体比如pET系列， pGEX系列，提取质粒，浓度不高很正常啊，因为他们不是克隆载体，他们的启动子是严谨型启动子，要想获得大量质粒，你可以做中抽或大抽质粒，而且你转化表达菌株也不需要那么大的质粒浓度，只要 ...

嗯，知道了，谢谢
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11楼2013-03-19 14:06:13
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huoyongting

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
同意楼上的，表达载体的拷贝数一般都是比较低的，你可以看下质粒图谱看看是什么ori ，但是T载体是高拷贝的，提的浓度低的话就不太正常了
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12楼2013-03-19 16:39:04
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by hua_geduo at 2013-03-19 14:05:46
原来摇了4ml的菌液提的质粒，效果还是不理想，我再试试吧，谢谢...

4ml菌液小提质粒不算很多，可以用10-20ml。
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13楼2013-03-20 03:07:50
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by hua_geduo at 2013-03-19 14:05:46
原来摇了4ml的菌液提的质粒，效果还是不理想，我再试试吧，谢谢...

4ml估计不够啊，9楼的见解和方法很好，有时候我会把菌液加到8ml，分成两管去裂解，然后都吸附到同一个柱子上。分部洗脱效率会高一些。
表达载体的质粒本来就不是很好提的。多尝试几次吧。如果是摇床有问题的话，你可以拿个温度计看看温度准不准，转速慢顶多就多摇几个小时摇到菌浓度够。
如果菌发青的话要考虑是不是死菌增多了
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14楼2013-03-20 12:06:59
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hua_geduo

木虫 (正式写手)
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14楼: Originally posted by sxxuan at 2013-03-20 12:06:59
4ml估计不够啊，9楼的见解和方法很好，有时候我会把菌液加到8ml，分成两管去裂解，然后都吸附到同一个柱子上。分部洗脱效率会高一些。
表达载体的质粒本来就不是很好提的。多尝试几次吧。如果是摇床有问题的话，你 ...

嗯，好的，谢谢你的建议，我再试试
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15楼2013-03-21 09:26:19
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hua_geduo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 潇潇溪 at 2015-05-06 11:21:08
我之前也有过这样的情况，也是T载体，后来我就把提出的质粒（虽然浓度低，但是还是有的情况下）化转一下，再挑取单菌落提质粒，就变浓了。你可以试一下，但是个中原因我还在找。希望能帮助到你。

谢谢你的建议，但是。。。。我这帖子是2013年的……你懂的
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17楼2015-05-06 14:32:41
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lcp_201418楼
2015-08-20 10:31   回复  
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