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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » BL21菌种提取质粒的问题
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liwuliwu

银虫 (初入文坛)

[求助] BL21菌种提取质粒的问题 已有3人参与

新手我已经确定构建好了一个真核表达载体，菌落PCR一直有目的条带，之后挑了单克隆摇菌在化板，再做菌落PCR还是有的，阴性和阳性对照都做过，没有问题，说明载体已经构建成功，由于手里没有用于克隆的DH5a,JM109等菌，就转化到了用于表达的BL21菌里，摇菌到一定浓度后，再去提质粒发现加入裂解液2后一直是浑浊的，但是裂解没有重组子的BL21立马就变清亮了，说明裂解液2没有问题，但是BL21里提取出来的质粒特别的少，而且感觉很不稳定（单双酶切发现都不对），但是具体不知道是什么原因，想请高手们找下原因，给我分析一下，是不是BL21不适合做质粒提取啊？但是都是大肠杆菌，那为什么重组子BL21菌加入裂解液后很难变清亮呢？（但是我又确定重组子BL21已经裂解了，因为我发现加入裂解液II后菌液变得粘稠而且有很多拉丝状的液体，听说那是菌体裂解后的核酸）。求高手解释。。本人感激不尽。。。。
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1楼 2014-11-05 17:02:21
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-05 23:06:23
bl21第一质粒拷贝数不高，第二容易提出核酸酶。

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2楼2014-11-05 17:23:17
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liwuliwu

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by myheat at 2014-11-05 17:23:17
bl21第一质粒拷贝数不高，第二容易提出核酸酶。

谢谢，但是为什么菌体裂解后还是不清亮的呢？而且我已经确定菌体裂解了，因为已经出现大量的粘稠状的核酸，再加大量裂解液还是不清亮？我很好奇，求高手解答。。。感激不尽。。
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3楼2014-11-06 08:58:37
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caihang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
BL21是表达菌，它的侧重点在表达蛋白，可能是它表达了质粒上的某些蛋白，造成裂解后还是浑浊的。DH5A可以去购买，也不是很贵，原菌的话，很多人都有。
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4楼2014-11-06 10:09:55
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a1353601094

新虫 (初入文坛)
是的。BL21菌我们一般都是要大抽的，做小抽的话量会很低（一般小于50ng/ul）大抽的话就正常了。还有1点就是BL21菌抽出来的质粒酶切（正常酶切时间）会出现拖带，带很糊情况。你可以把酶切时间减少（15分钟左右）这样就好了
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5楼2015-06-24 21:07:24
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

哈哈，那你载体构建的时候转的什么感受态？当时就转的BL21吗？那那时你是怎么提出质粒送去测序的呢？

[ 发自小木虫客户端 ]
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天道酬勤
6楼2015-06-24 21:51:31
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