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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒提取和扩增鉴定
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xjtu0025

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒提取和扩增鉴定

从别人那里借来的滤纸上面的质粒,无菌水溶了以后,用感受态转了.天根的.
涂板后,14小时,长出众多单菌落.阴性对照无菌落生成.
挑单菌落,5ml试管摇管,12小时.
一共5个管,两个有浑浊,另外三个没反应.取浑浊的两个其中一个抽提质粒.
提出来一个不到5000bp的单一条带
但是我借的质粒是pcDNA3.1, 大小是5400左右呀...

那我提取的是啥东西呀...

如果我要鉴定是不是用两个不同的单酶切一下?

还是因为我marker没有完全跑开?但是挺明显目标条带不到5000,因为marker指示条带是5000的..

如果说是污染了杂菌,我总不能刚好是实验组污染,阴性对照就没污染吧...

还是说我挑单菌落的时候有的挑的的多,有的挑的少导致有的试管不长...

求问解决办法?
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1楼 2013-04-25 23:17:24
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sl35537417

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-04-26 14:55:47
你怎么确定其大小不到5000bp  是跟marker比吗？ 质粒是不能根据marker大小判定其大小的  因为质粒是环状的 而marker是线性的；所以其迁移的速率也不一样
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2楼2013-04-26 08:32:36
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sl35537417 at 2013-04-26 08:32:36
你怎么确定其大小不到5000bp  是跟marker比吗？ 质粒是不能根据marker大小判定其大小的  因为质粒是环状的 而marker是线性的；所以其迁移的速率也不一样

谢谢!我后来也想到了这个..但是我还是有点疑问,因为以前提的质粒都是三条带的...这次只有一个有点不确定..
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3楼2013-04-26 08:37:03
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sl35537417

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-04-26 08:37:03
谢谢!我后来也想到了这个..但是我还是有点疑问,因为以前提的质粒都是三条带的...这次只有一个有点不确定.....

理论上质粒是三种形态  但是这三种形态的比例是跟溶液的盐离子浓度、PH等等有关的  所以看不到也不见得就不是
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4楼2013-04-26 08:49:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-04-26 08:37:03
谢谢!我后来也想到了这个..但是我还是有点疑问,因为以前提的质粒都是三条带的...这次只有一个有点不确定.....

一般用盒子提质粒绝大部分都是超螺旋形式的，除非操作时特别粗暴。如果用自己配溶液，酚氯仿抽提的话，机械力较大，往往可以看见多条带。
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5楼2013-04-26 09:12:07
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sunyiyang

新虫 (初入文坛)
质粒跑的快慢和琼脂糖凝胶的浓度也有关系
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6楼2014-04-21 23:58:29
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