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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 我的JM109-pKD46质粒的电击感受态转化效率怎么一直都提不上去呢
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wwwpengcs

铜虫 (初入文坛)

[求助] 我的JM109-pKD46质粒的电击感受态转化效率怎么一直都提不上去呢 已有3人参与

大家好，我最近在做JM109菌株的敲除实验，JM109内导入了一个pKD46质粒，用10%的甘油洗了两次。制作感受态的一些基本方面都注意到了，因为我之前做了很多电击与热击的感受态，热击的感受态转化效率一直都非常高。我检测我的感受态的转化率是直接导入了一个与pKD46（氨苄抗性）质粒兼容的pET-30a(卡纳抗性）质粒，用双抗板来检测。但是每次导入pET-30a质粒后，双抗板上要么是没有长出菌，要么是染了少许杂菌。pKD46质粒的复制子是R101，pET-30a的复制子是pBR322。可以肯定的是，这两个质粒是完全可以兼容的。做了一年，实验卡在这了，求知道的高手能够帮我好心解答一下下~~~（金币不多额，因为这是注册3年来在虫虫上发的第一个帖）
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我心永恒
1楼 2014-08-24 09:04:27
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bolysu

禁虫 (著名写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
2楼2014-08-25 16:11:27
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wwwpengcs

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bolysu at 2014-08-25 16:11:27
JM109-pKD46你已经导入pKD46了？你是怎么导入的啊？效率怎么样？我前期导BL21，死活导不进去。那你 导PET30的目的是什么？  据我所知JM109是敲掉recA的，你是敲不掉基因的了

pKD46当然是用热击的方法导入的啊。转pET30是为了检测JM109-pKD46电击感受态的转化效率啊！
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我心永恒
3楼2014-08-25 21:01:22
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

我想问的是，你能够用化学转化的方法去检测电转感受态？我做得是Ecoli.K12-MG1655含pKD46的电转感受态，制作了3次感受态，第一次长了2个，第二次1个，第3次长得就多了，我感觉是要控制好OD600的值，在诱导pKD46的时候，那个值最好是在0.2~0.25之间，而最后的OD600值，不要超过0.55，还有就是你摇菌时，瓶里的溶氧量，一般是用500ml的培养瓶，摇100ml LB，希望对你有用。
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4楼2015-02-03 00:46:45
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浅语8905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果只是确认电转感受转化率，为什么一定要导一个质粒进去呢，这样不是增加了菌的生长负担吗
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5楼2015-02-03 09:25:04
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wwwpengcs

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 张凡云 at 2015-02-03 00:46:45
我想问的是，你能够用化学转化的方法去检测电转感受态？我做得是Ecoli.K12-MG1655含pKD46的电转感受态，制作了3次感受态，第一次长了2个，第二次1个，第3次长得就多了，我感觉是要控制好OD600的值，在诱导pKD46的时 ...

不是啊，电转入一个与其共存的质粒来检测其转化率啊。恩，OD600值很重要，ara诱导的时间也很重要！谢谢你的帮助！
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我心永恒
6楼2015-02-05 00:11:55
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wwwpengcs

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 浅语8905 at 2015-02-03 09:25:04
如果只是确认电转感受转化率，为什么一定要导一个质粒进去呢，这样不是增加了菌的生长负担吗

为了保证每一步的正确性啊，如果感受态的转化效率不高，那么后期用线性DNA片段去敲除，若是不成功，那也无法具体分析是哪一步出现了问题啊。
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我心永恒
7楼2015-02-05 00:12:57
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