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转化感受态后提取质粒,测浓度总是很低
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hua_geduo
木虫
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虫号: 2114661
[交流]
转化感受态后提取质粒,测浓度总是很低
年前做表达,目的片段连接到T载体上,然后转化,挑菌,摇菌,提取质粒,测质粒浓度总是很低;现在我的表达载体量不够了,想转化后提取,使量大一点,但是发现提取后测浓度又遇到同样的状况,请问这是怎么回事啊?用的感受态是DH5α,提质粒的试剂盒是爱思进的,实验卡在这里了,急求帮助!
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1楼
2013-03-19 09:48:17
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hua_geduo
木虫
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虫号: 2114661
引用回帖:
14楼
:
Originally posted by
sxxuan
at 2013-03-20 12:06:59
4ml估计不够啊,9楼的见解和方法很好,有时候我会把菌液加到8ml,分成两管去裂解,然后都吸附到同一个柱子上。分部洗脱效率会高一些。
表达载体的质粒本来就不是很好提的。多尝试几次吧。如果是摇床有问题的话,你 ...
嗯,好的,谢谢你的建议,我再试试
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15楼
2013-03-21 09:26:19
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xuchenxi121
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虫号: 1062624
★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
通常不会是感受态的问题,而是提取质粒的问题,用试剂盒提取时很大可能会有质粒在柱子上洗脱不彻底的情况,因此建议可以将Elution加热后再洗脱,可显著提高得率。
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2楼
2013-03-19 10:23:41
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玉米头
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★ ★ ★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励来分子生物版块发贴交流!
2013-03-19 12:22:49
我也遇到过这种情况,质粒得率低,做了好多次都是这样,你可以换成JM109的,我试过,效果很好。这可能是DH5a不大适合T载体的扩增。
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3楼
2013-03-19 10:31:14
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sxxuan
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在线: 266.1小时
虫号: 512865
★ ★ ★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 很好的建议,鼓励交流哈!
2013-03-19 12:26:44
是先划板活化后再挑菌放大摇菌是吗?
我以前用DH5a做宿主培养提取质粒也没问题的。
会不会是你的质粒拷贝数比较低?试着用低拷贝的质粒抽提试剂盒看看会不会好一些?
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4楼
2013-03-19 10:52:35
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