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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 质粒的提取及测序问题
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yumupeipei

铜虫 (小有名气)

[求助] 质粒的提取及测序问题 已有2人参与

最近在做转化，挑取阳性单克隆摇菌后，菌液PCR有目的片段（1800bp），提质粒，电泳发现无条带，可用该质粒做模板进行PCR能出现目的条带，送样进行测序，也总是反馈说信号太弱，这到底是怎么回事，还望各位大虾指点！
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1楼 2014-03-10 10:01:48
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dnvcqw

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yumupeipei: 金币+8 2014-03-10 11:23:27
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-10 19:41:44
yumupeipei: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-03-25 08:30:51
我觉得是不是需要确认一下做的胶是否正常，因为既然既然能用质粒pcr做出东西来，里面肯定还是存在着模板的，反应弱无非就是模板的浓度不够或者是引物结合的效率有问题，根据你的描述我觉得浓度的原因更大，可以用目的基因的引物来P一下质粒，用其产物测序也是可以验证一下的

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yumupeipei
2楼2014-03-10 11:10:42
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yumupeipei: 金币+5 2014-03-10 11:23:11
yumupeipei: 金币+1, ★有帮助 2014-03-25 08:31:02
提质粒，电泳发现无条带。点了多少样？可以试着多一点质粒，估计浓度小了。
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3楼2014-03-10 11:11:48
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licunyu

铁虫 (初入文坛)
会不会质粒浓度太低啊？楼主是单纯的质粒保种吗？还是构建的重组质粒？
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4楼2014-03-10 11:15:03
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_hwq

新虫 (初入文坛)
你用菌送去测序的吗?

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5楼2014-03-10 11:16:38
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yumupeipei

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by dnvcqw at 2014-03-10 11:10:42
我觉得是不是需要确认一下做的胶是否正常，因为既然既然能用质粒pcr做出东西来，里面肯定还是存在着模板的，反应弱无非就是模板的浓度不够或者是引物结合的效率有问题，根据你的描述我觉得浓度的原因更大，可以用目 ...

恩，谢谢您的建议。今天我也咨询了华大的客服，他们说可能是质粒的浓度太低了，他建议我加大摇菌的量，我先用自己的引物试一下，看看会不会出结果，实在不行了，再大摇！
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6楼2014-03-10 11:22:48
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yumupeipei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by licunyu at 2014-03-10 11:15:03
会不会质粒浓度太低啊？楼主是单纯的质粒保种吗？还是构建的重组质粒？

我用的表达载体，想确定是否存在突变，然后直接做表达
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7楼2014-03-10 11:24:31
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yumupeipei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by _hwq at 2014-03-10 11:16:38
你用菌送去测序的吗?

是的
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8楼2014-03-10 11:24:39
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_hwq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yumupeipei at 2014-03-10 11:24:39
是的

你质粒的拷贝数是多少？

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9楼2014-03-10 11:42:44
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lcp_2014

新虫 (初入文坛)
请问你的问题最终怎么解决的 我也遇到相同的问题
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10楼2015-08-20 10:28:19
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