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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何提高PET-28a质粒提取浓度？
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liudianlei

银虫 (小有名气)

[求助] 如何提高PET-28a质粒提取浓度？

在提取质粒时，转化摇菌培养提取，跑电泳，条带总是很暗，加入氯霉素摇菌提取也不是很亮，如何提高质粒提取时的浓度问题？还有就是PET系列的质粒拷贝数大约是多少，有没有用过拷贝数很大的PET系列的质粒?
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1楼 2012-12-30 20:36:32
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

liudianlei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by dmzha at 2012-12-31 10:22:25
pET-28a的抗性是卡纳吧？你怎么用氯霉素呢？我用的卡纳工作浓度是50 微克/ml，提的质粒条带挺亮的。

我在LB中加入KANA了，加氯霉素·是为了提高质粒的拷贝数
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5楼2012-12-31 19:46:55
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 正解，专业！ 2012-12-31 16:44:02
liudianlei: 金币+2, ★有帮助 2012-12-31 19:51:13
拷贝数是看质粒的复制类型。pET系列的载体是用于表达，而不是克隆，所以拷贝数不是特别高的。如果想得到浓度高的质粒简单的办法就是多裂解菌，最后elute的时候少用些buffer。
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2楼2012-12-31 06:30:10
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dmzha

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liudianlei: 金币+1, ★有帮助 2012-12-31 19:51:00
pET-28a的抗性是卡纳吧？你怎么用氯霉素呢？我用的卡纳工作浓度是50 微克/ml，提的质粒条带挺亮的。
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3楼2012-12-31 10:22:25
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liudianlei: 金币+2, ★有帮助 2012-12-31 19:50:50
首先，我没记错的话pET28a是Kana抗性，然后提取质粒用的菌液最好不要摇超过12小时，不然得率会下降很多，用试剂盒提取的话，不要超过5ml，不然得率不升反降，洗脱液大于50ul.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
4楼2012-12-31 10:27:30
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liudianlei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-31 06:30:10
拷贝数是看质粒的复制类型。pET系列的载体是用于表达，而不是克隆，所以拷贝数不是特别高的。如果想得到浓度高的质粒简单的办法就是多裂解菌，最后elute的时候少用些buffer。

裂解多少是比较合适的，加BUFFER加多少比较好
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6楼2012-12-31 19:48:26
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liudianlei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Marado at 2012-12-31 10:27:30
首先，我没记错的话pET28a是Kana抗性，然后提取质粒用的菌液最好不要摇超过12小时，不然得率会下降很多，用试剂盒提取的话，不要超过5ml，不然得率不升反降，洗脱液大于50ul.

我摇菌一般是七八个小时，然后加入氯霉素，再摇十几个小时，我有时候菌体量比较少，加入的会多点，会加6ML左右，下次减一下试试。
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7楼2012-12-31 19:50:40
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liudianlei: 金币+1 2013-01-01 21:11:55
pET又不能用来转染要那么多量也没用啊
嫌量少就多摇些菌 每个样做两个miniprep
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8楼2013-01-01 00:00:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by liudianlei at 2012-12-31 19:48:26
裂解多少是比较合适的，加BUFFER加多少比较好...

这要看你最后需要的质粒用量和浓度。一般上10-20ml菌液。裂解液用2-3倍的普通小提。elute的时候可以用两次洗脱，每次用25-30ul。
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9楼2013-01-01 03:03:44
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cxj.nt

金虫 (正式写手)
可以手提啊，我们一般手提质粒。
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10楼2013-03-09 10:52:05
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