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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助连接转化质粒提取
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kenhtsjj

木虫 (小有名气)

[求助] 求助连接转化质粒提取

请教一下，在我连接转化以后，菌液PCR能检测到单一的目的条带，但是隔日我提取质粒却提不出来了，我的载体5K，目的片段2k，但是质粒提取是在750-1k之前有一片拖带，没有任何条带，这是为什么呢？？

另外，如何能够提高质粒提取的量？我用的是普通的质粒小提试剂盒，我的提出来都在40ng/μl左右，但是人家都说能达到好几百？请教。谢谢各位！
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kenhtsjj

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1楼 2012-06-04 11:37:26
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-06-04 20:08:56
先用成熟质粒试试，提出来效果如何，试剂盒的效率如何，一般试剂盒是没有问题的，质粒提取与你摇菌的浓度，裂解是否彻底，中和是否完全，还有最后一步洗脱的量有关，总之这些条件你的摸索，如果你是做得多了，肯定会积累一些经验 的！
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2楼2012-06-04 15:41:32
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kenhtsjj

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by smdsfy at 2012-06-04 15:41:32
先用成熟质粒试试，提出来效果如何，试剂盒的效率如何，一般试剂盒是没有问题的，质粒提取与你摇菌的浓度，裂解是否彻底，中和是否完全，还有最后一步洗脱的量有关，总之这些条件你的摸索，如果你是做得多了，肯定会 ...

谢谢！我用这个试剂盒提过的，试剂盒应该没有问题。
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3楼2012-06-04 18:38:13
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steler_ly
4楼2012-06-07 13:48:21
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yanying198

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kenhtsjj: 金币+2, ★有帮助, 我用的是热激，这个操作应该是没有什么问题，再换盒子尝试中~~~谢谢~ 2012-06-10 13:32:10
kenhtsjj: 金币+1 2012-06-10 13:32:50
菌落PCR有时候会产生假阳性。用热激的方法转化，效率应该挺高的，我们一般是直接挑单克隆，然后提取质粒，电泳验证。
提取质粒最重要的是加溶液III，千万不可以剧烈，否则质粒会断裂。个人想法，可以参考。
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5楼2012-06-07 21:13:48
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
kenhtsjj: 金币+2, ★有帮助, 谢谢！ 2012-06-10 13:32:36
个人认为PCR不是十分准确的，至于质粒提不出来，如果试剂盒没问题的话，那就是质粒本身的问题，按说明书操作一般不会有什么问题，我今天提的质粒就是浓度不高也就五六十的样子，但给师姐带的两个样就400多。还有可以多摇点菌液，密度大一点再提也许会好一点，个人观点，仅供参考！
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6楼2012-06-07 22:10:35
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kenhtsjj

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
谢谢，但是我的PCR也做了对照啊，而且我就是直接用质粒又转到BL21里，所以我觉得菌液的影响也比较大，其次试剂盒也有好坏之分，我再试试。感谢

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2012-06-09 23:18:21
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tangyuntao

铜虫 (小有名气)
我也遇到相同的问题，感谢楼主，我还是再摇下菌吧。
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博学而笃志，切问而近思。
8楼2012-12-18 17:31:25
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kenhtsjj

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by tangyuntao at 2012-12-18 17:31:25
我也遇到相同的问题，感谢楼主，我还是再摇下菌吧。

谢谢，祝实验顺利
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9楼2012-12-20 15:09:03
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lw90417

新虫 (初入文坛)
★ ★
wizardfan: 金币+2, 鼓励新虫发帖 2013-01-13 09:46:15
载体还是很重要的！例如PSK的和PMD的同样提取浓度就不一样。菌液浓度也是很重要的。PCR检测确实不是很准
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10楼2013-01-12 22:41:48
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