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kenhtsjj

木虫 (小有名气)

[求助] 求助连接转化质粒提取

请教一下,在我连接转化以后,菌液PCR能检测到单一的目的条带,但是隔日我提取质粒却提不出来了,我的载体5K,目的片段2k,但是质粒提取是在750-1k之前有一片拖带,没有任何条带,这是为什么呢??

另外,如何能够提高质粒提取的量?我用的是普通的质粒小提试剂盒,我的提出来都在40ng/μl左右,但是人家都说能达到好几百?请教。谢谢各位!
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-06-04 20:08:56
先用成熟质粒试试,提出来效果如何,试剂盒的效率如何,一般试剂盒是没有问题的,质粒提取与你摇菌的浓度,裂解是否彻底,中和是否完全,还有最后一步洗脱的量有关,总之这些条件你的摸索,如果你是做得多了,肯定会积累一些经验 的!
2楼2012-06-04 15:41:32
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kenhtsjj

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by smdsfy at 2012-06-04 15:41:32
先用成熟质粒试试,提出来效果如何,试剂盒的效率如何,一般试剂盒是没有问题的,质粒提取与你摇菌的浓度,裂解是否彻底,中和是否完全,还有最后一步洗脱的量有关,总之这些条件你的摸索,如果你是做得多了,肯定会 ...

谢谢!我用这个试剂盒提过的,试剂盒应该没有问题。
3楼2012-06-04 18:38:13
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4楼2012-06-07 13:48:21
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yanying198

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kenhtsjj: 金币+2, 有帮助, 我用的是热激,这个操作应该是没有什么问题,再换盒子尝试中~~~谢谢~ 2012-06-10 13:32:10
kenhtsjj: 金币+1 2012-06-10 13:32:50
菌落PCR有时候会产生假阳性。用热激的方法转化,效率应该挺高的,我们一般是直接挑单克隆,然后提取质粒,电泳验证。
提取质粒最重要的是加溶液III,千万不可以剧烈,否则质粒会断裂。个人想法,可以参考。
5楼2012-06-07 21:13:48
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
kenhtsjj: 金币+2, 有帮助, 谢谢! 2012-06-10 13:32:36
个人认为PCR不是十分准确的,至于质粒提不出来,如果试剂盒没问题的话,那就是质粒本身的问题,按说明书操作一般不会有什么问题,我今天提的质粒就是浓度不高也就五六十的样子,但给师姐带的两个样就400多。还有可以多摇点菌液,密度大一点再提也许会好一点,个人观点,仅供参考!
6楼2012-06-07 22:10:35
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kenhtsjj

木虫 (小有名气)

送鲜花一朵
谢谢,但是我的PCR也做了对照啊,而且我就是直接用质粒又转到BL21里,所以我觉得菌液的影响也比较大,其次试剂盒也有好坏之分,我再试试。感谢

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
7楼2012-06-09 23:18:21
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tangyuntao

铜虫 (小有名气)

我也遇到相同的问题,感谢楼主,我还是再摇下菌吧。
博学而笃志,切问而近思。
8楼2012-12-18 17:31:25
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kenhtsjj

木虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by tangyuntao at 2012-12-18 17:31:25
我也遇到相同的问题,感谢楼主,我还是再摇下菌吧。

谢谢,祝实验顺利
9楼2012-12-20 15:09:03
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lw90417

新虫 (初入文坛)

★ ★
wizardfan: 金币+2, 鼓励新虫发帖 2013-01-13 09:46:15
载体还是很重要的!例如PSK的和PMD的同样提取浓度就不一样。菌液浓度也是很重要的。PCR检测确实不是很准
10楼2013-01-12 22:41:48
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