| 查看: 2821 | 回复: 11 | |||
dongyan08木虫 (正式写手)
|
[交流]
转化后提不出质粒 已有11人参与
|
||
|
我做完转化后，平板上有长菌，挑了几个培养了8个小时后，做了菌落PCR，都P出来了，只有我要的条带，但是提质粒浓度却很低，请问各位有没遇到这种情况的？我的培养基室温放了一个月没用了，不知道会不会有影响？ 同时我转了一个纯质粒，提的质粒浓度也很低。 [ Last edited by dongyan08 on 2012-9-7 at 16:38 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有94人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 菌液pcr出来后，质粒提不出，测序老失败？
已经有6人回复
- 求助连接转化质粒提取
已经有9人回复
- 提取的质粒跑出四条或者五条带，但酶切后只有一条带，是不是我的质粒污染了
已经有18人回复
- 氨苄平板
已经有14人回复
- 质粒构建
已经有13人回复
- 做酶切连接后转化再提质粒，质粒明显变小，Why???
已经有24人回复
- 质粒怎么会提不出来'?
已经有12人回复
- 菌液PCR是阳性，却提不出来阳性质粒！求助
已经有31人回复
- 菌株构建成功后，再复苏保存的菌种，提不出质粒，怎么办？
已经有9人回复
- 质粒转染成功后质粒小提出现了问题
已经有4人回复
- 酵母质粒转化及提取验证问题求助
已经有12人回复
- pMG36e 构建的奇怪现象
已经有29人回复
- 【求助/交流】表达载体转化后,提取的质粒和原来不一样了啊
已经有5人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌转化质粒，出来的不是我要的了，怎么回事？
已经有13人回复
- 【求助/交流】检测都目的片段，但提不出质粒！
已经有5人回复
- 【求助/交流】质粒提取不出来--郁闷
已经有24人回复
- 【求助/交流】为何提不出质粒来
已经有12人回复
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解： 1、 大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 2、 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可放大培养量，也可将LB更换成2YT，TB等更高营养的培养液，另外可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 3、 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 4、 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 5、 溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。 6、 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。 7、 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 8、 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 9、 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 10、 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。 11、 洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。 12、 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可达到较好的效果。 |
4楼2012-09-08 06:59:59
gwd0312
木虫 (正式写手)
“无冕之王”
- MolEPI: 5
- 应助: 131 (高中生)
- 金币: 1973.2
- 红花: 10
- 帖子: 418
- 在线: 88.3小时
- 虫号: 1067565
- 注册: 2010-08-01
- 性别: GG
- 专业: 质谱分析
2楼2012-09-07 17:24:23
3楼2012-09-08 00:28:12
5楼2012-10-20 12:33:42
6楼2012-10-21 00:02:11
b6122
木虫 (正式写手)
- 应助: 37 (小学生)
- 金币: 2987.9
- 散金: 1000
- 红花: 5
- 帖子: 636
- 在线: 46.9小时
- 虫号: 172913
- 注册: 2006-01-20
- 专业: 生物医用高分子材料
7楼2013-10-31 11:47:32
8楼2014-05-22 21:40:56
9楼2014-05-25 11:45:36
10楼2014-05-25 16:16:00
