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caiyouhua1983

金虫 (正式写手)

[交流] 请教不知道质粒信息的情况下,怎样设计引物来进行测序 已有4人参与

请教各位虫友,我有个菌里面有个质粒,试了各种常用的抗性(amp,kan,cm,ter等),都不能长,在对这个质粒信息一概不知的情况下,请问有没有什么较理想的办法,知道这个质粒的信息?怎样去设计测序引物,能不能从启动子和复制子这块下手?质粒的复制子序列都一样吗?多谢~!
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质粒构建 测序相关问题

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tianhome

木虫 (知名作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
把你发现的质粒纯化出来,理论上,可以根据启动子和复制子测序,但启动子和复制子序列不尽相同,可以试一下。那么你是怎么发现的这个质粒的呢,从这方面或许可以找到线索。

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虫洞
2楼2013-03-17 03:41:25
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XOooZzz

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
质粒能提取出来吗?提质粒,酶切,连到测序载体,测序。
3楼2013-03-17 08:56:44
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caiyouhua1983

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by XOooZzz at 2013-03-17 08:56:44
质粒能提取出来吗?提质粒,酶切,连到测序载体,测序。

感谢回复,质粒已经提取出来了,拷贝数很低,那是用单酶切,还是双酶切呢?能讲得具体点吗?
正确对待别人,清醒对待自己!
4楼2013-03-17 11:03:13
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caiyouhua1983

金虫 (正式写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by tianhome at 2013-03-17 03:41:25
把你发现的质粒纯化出来,理论上,可以根据启动子和复制子测序,但启动子和复制子序列不尽相同,可以试一下。那么你是怎么发现的这个质粒的呢,从这方面或许可以找到线索。

表达载体的复制子序列,是有限的几种吗?是那几个序列?多谢!
正确对待别人,清醒对待自己!
5楼2013-03-17 11:07:58
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)



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提出质粒后。找几个酶切切看,出来片段的话就连到同样酶切的克隆载体上。用载体引物进行测序。
6楼2013-03-17 14:07:28
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XOooZzz

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by caiyouhua1983 at 2013-03-17 11:03:13
感谢回复,质粒已经提取出来了,拷贝数很低,那是用单酶切,还是双酶切呢?能讲得具体点吗?...

都可以,片段太大的话双酶切。你先找一两个能切开目标质粒的酶,然后酶切连入测序载体测序。
考虑到你的目标质粒上可能有抑制感受态细菌生长、质粒复制的元件,最好能将质粒切成若干片段分别连接测序。当然,运气好的话一次连接测序就搞掂了。
7楼2013-03-17 17:31:36
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dynamicren

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
估计你的是隐蔽质粒吧,对这个的研究我有过关注,通常是提取出来后,选一些常见的限制性内切酶进行酶切,然后再选一两个切得开的酶切回收后连入T载体测序。根据这部分测序所得的已知序列进行geneome walking测序,就行了。
8楼2014-09-25 07:50:53
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