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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因的下半部分已经测序完成，引物设计了两次上半部分总是扩不出来是什么原因？
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aaaapple

铁虫 (初入文坛)

[求助] 基因的下半部分已经测序完成，引物设计了两次上半部分总是扩不出来是什么原因？

我已经扩出了鲤鱼STAT6下半部分的基因，与鲑鱼STAT6的相似性是百分之八十四，利用已经扩出的片段设计引物，可是设计了两次还是无法扩出上游的片段。已经做了几个星期了，还是没得结果。不知道出了什么问题。是不是测序所得的序列根本不是STAT6的基因呢？或者是不是有其他原因导致无法扩出，新手金币不多，希望高手能指点一二！
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1楼 2012-11-16 13:43:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aaaapple: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-11-19 10:17:38
你用下游序列设计引物不可能扩增出上游序列。而一般要在这个基因上游的保守区设计简并引物。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2012-11-18 10:35:48
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普通回帖

yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aaaapple: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-11-19 10:15:34
原因有很多啊。 引物位置和结合问题、是否存在高GC含量区域、高级结构、试剂污染、DNA降解等等。设计对照，一个个排除原因吧。
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2楼2012-11-17 14:51:01
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aaaapple: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 很有帮助谢谢！ 2012-11-19 10:11:22
你这个情况不要再普通pcr了,如果STAT6不是特别长的话,直接5'race和3'race,目的应该是拿全长吧,再扩也是浪费时间
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4楼2012-11-18 18:41:33
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aaaapple

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by titus0805 at 2012-11-18 18:41:33
你这个情况不要再普通pcr了,如果STAT6不是特别长的话,直接5'race和3'race,目的应该是拿全长吧,再扩也是浪费时间

我上游还有1000多bp,STAT其他基因已经开始做RACE了，用RACE可以扩这么大的片段吗？好像普通测序只能测750左右的片段吧。
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5楼2012-11-19 10:10:54
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aaaapple

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yixuanwin at 2012-11-17 14:51:01
原因有很多啊。 引物位置和结合问题、是否存在高GC含量区域、高级结构、试剂污染、DNA降解等等。设计对照，一个个排除原因吧。

的确是存在一些发卡结果在设计的引物当中，我所需的片段是1200左右，但是扩出了1500的片段没有送去测序，只有肌肉组织中出现了1200的片段送去测序但是BLAST之后发现不是目的基因。  
DNA降解，试剂污染，GC含量，高级结构都应该没得问题吧
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6楼2012-11-19 10:15:22
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aaaapple

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-18 10:35:48
你用下游序列设计引物不可能扩增出上游序列。而一般要在这个基因上游的保守区设计简并引物。

实在不行  试下也行！但是用斑马鱼和鲑鱼找保守区的时候我凌乱了，我估计设计一条引物价格不菲哦因为估计最低有四五个简并位点  呵呵     我估计不到万不得已不会这样，我已经重新设计两次的原因也是如此，
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7楼2012-11-19 10:20:57
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秋雨心寒

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1200bp测序是可以，但是效果会很不好。建议你可以考虑一下巢氏PCR，把基因前后多拿点下来，然后分段PCR扩增测序。
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8楼2012-11-19 10:30:37
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by aaaapple at 2012-11-19 10:10:54
我上游还有1000多bp,STAT其他基因已经开始做RACE了，用RACE可以扩这么大的片段吗？好像普通测序只能测750左右的片段吧。...

1000bp不算很长，race应该没鸭梨，可以咨询试剂公司问他们的产品能race多长；测序可以两端测
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9楼2012-11-19 13:01:30
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aaaapple

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 秋雨心寒 at 2012-11-19 10:30:37
1200bp测序是可以，但是效果会很不好。建议你可以考虑一下巢氏PCR，把基因前后多拿点下来，然后分段PCR扩增测序。

STAT6 这个基因1600左右，我分成两段分别设计引物，第一段1200.第二段600，现在已经拿到600的了，我利用下面的600重新设计了两次下游的引物，但是居然一点反应都没得。
如果现在就做RACE 我怕引物都不好设计类，还有测序只能测750左右，所以现在做RACE怕不太合适，而且还不知道1600前面还有多少碱基。
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10楼2012-11-19 16:54:59
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