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aaaapple

铁虫 (初入文坛)

[求助] 基因的下半部分已经测序完成,引物设计了两次上半部分总是扩不出来是什么原因?

我已经扩出了鲤鱼STAT6下半部分的基因,与鲑鱼STAT6的相似性是百分之八十四,利用已经扩出的片段设计引物,可是设计了两次还是无法扩出上游的片段。已经做了几个星期了,还是没得结果。不知道出了什么问题。是不是测序所得的序列根本不是STAT6的基因呢?或者是不是有其他原因导致无法扩出,新手金币不多,希望高手能指点一二!
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by aaaapple at 2012-11-19 10:10:54
我上游还有1000多bp,STAT其他基因已经开始做RACE了,用RACE可以扩这么大的片段吗?好像普通测序只能测750左右的片段吧。...

1000bp不算很长,race应该没鸭梨,可以咨询试剂公司问他们的产品能race多长;测序可以两端测
9楼2012-11-19 13:01:30
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
aaaapple: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-11-19 10:15:34
原因有很多啊。 引物位置和结合问题、是否存在高GC含量区域、高级结构、试剂污染、DNA降解等等。设计对照,一个个排除原因吧。
2楼2012-11-17 14:51:01
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
aaaapple: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-11-19 10:17:38
你用下游序列设计引物不可能扩增出上游序列。而一般要在这个基因上游的保守区设计简并引物。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2012-11-18 10:35:48
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
aaaapple: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 很有帮助谢谢! 2012-11-19 10:11:22
你这个情况不要再普通pcr了,如果STAT6不是特别长的话,直接5'race和3'race,目的应该是拿全长吧,再扩也是浪费时间
4楼2012-11-18 18:41:33
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