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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因的下半部分已经测序完成，引物设计了两次上半部分总是扩不出来是什么原因？
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aaaapple

铁虫 (初入文坛)

[求助] 基因的下半部分已经测序完成，引物设计了两次上半部分总是扩不出来是什么原因？

我已经扩出了鲤鱼STAT6下半部分的基因，与鲑鱼STAT6的相似性是百分之八十四，利用已经扩出的片段设计引物，可是设计了两次还是无法扩出上游的片段。已经做了几个星期了，还是没得结果。不知道出了什么问题。是不是测序所得的序列根本不是STAT6的基因呢？或者是不是有其他原因导致无法扩出，新手金币不多，希望高手能指点一二！
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1楼 2012-11-16 13:43:31
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秋雨心寒

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1200bp测序是可以，但是效果会很不好。建议你可以考虑一下巢氏PCR，把基因前后多拿点下来，然后分段PCR扩增测序。
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8楼2012-11-19 10:30:37
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aaaapple: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-11-19 10:15:34
原因有很多啊。 引物位置和结合问题、是否存在高GC含量区域、高级结构、试剂污染、DNA降解等等。设计对照，一个个排除原因吧。
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2楼2012-11-17 14:51:01
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aaaapple: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-11-19 10:17:38
你用下游序列设计引物不可能扩增出上游序列。而一般要在这个基因上游的保守区设计简并引物。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2012-11-18 10:35:48
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aaaapple: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 很有帮助谢谢！ 2012-11-19 10:11:22
你这个情况不要再普通pcr了,如果STAT6不是特别长的话,直接5'race和3'race,目的应该是拿全长吧,再扩也是浪费时间
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4楼2012-11-18 18:41:33
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