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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】ITS测序
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xclj369ouc

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】ITS测序 已有13人参与

请教大家谁有测过ITS序列？
是直接PCR产物测序的，还是克隆测序的啊？
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1楼 2010-05-09 12:11:09
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
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amisking(金币+2):招版主！ 2010-05-09 13:34:26
我PCR产物不纯化就送去测序，测过超过20条序列。不过最好不要有干扰测序公司纯化的杂带，量也要达到他们的要求。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2010-05-09 13:17:17
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nklyw

木虫 (正式写手)
两者都行吧  不过送测之前要纯化的
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3楼2010-05-09 13:23:57
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long5lizi

新虫 (初入文坛)
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1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-05-09 17:33:28
我们一般是PCR以后再去测序的。
    无论是哪种方法得到的序列，在自动测序仪上都具有测序引物与模板的识别、结合过程，使得靠近引物端的碱基测序信号弱，不易读出。对于克隆测序，读不出的是部分载体序列，而直接测序读不出的是ITS片段的部分序列，所以前者所得序列的更符合ITS全长。
    但直接测序要快速方便，而克隆测序费时费力
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4楼2010-05-09 14:41:41
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
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1949stone(金币+1):够热心 2010-05-09 17:33:42
ITS不长，只要双向各一个反应就测出来了，每个反应的开头都不绝对准，尾部准，拼接之后得到准确的序列。相反，克隆过程中可能出错，可信度不高的，投稿的时候会被评阅人问的。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2010-05-09 16:35:39
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QIN0718

至尊木虫 (职业作家)
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-05-09 17:34:01
ITS测序:提取菌种总DNA,跟生物公司定ITS通用引物，pcr扩增ITS，测序，blast比对，建进化树，推断菌种分类
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6楼2010-05-09 16:51:28
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wwllkkhh

金虫 (小有名气)
★
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两个都可以
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牛~逼~哄~哄
7楼2010-05-09 18:05:09
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
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引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2010-05-09 16:35:39:
ITS不长，只要双向各一个反应就测出来了，每个反应的开头都不绝对准，尾部准，拼接之后得到准确的序列。相反，克隆过程中可能出错，可信度不高的，投稿的时候会被评阅人问的。

我想知道克隆出错是怎么回事？能说一下具体怎么出错吗？谢谢了
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8楼2010-05-09 20:39:35
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gaiyf

金虫 (正式写手)
★
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我做过的真菌都是用its引物扩的，也就是说测得是ITS序列，我是pcr完了后又转化克隆再测得，当然现在有很多公司可以直接测pcr产物的
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多看文献，多学知识
9楼2010-05-09 21:28:44
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
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reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-23 06:04:53
首先转录酶有很多种，虽然准确度很高，但是扩增产物多，即使是一亿分之一的出错率，也会有极少数碱基出错。
连接到载体上之后转化宿主，在宿主体内扩增的过程中，由一个拷贝增加到亿个拷贝，宿主的扩增系统会产生极少数碱基出错。
宿主邮寄到测序公司后进行扩增提取质粒，质粒又进行多次扩增，也可能出错。当然也可以用菌体PCR，不过难度明显比用质粒为模板高。

这下应该明白我为什么用PCR产物来测序了吧？
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10楼2010-05-09 21:50:11
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