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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】ITS测序
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fwks

铁杆木虫 (小有名气)
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Originally posted by yujiaping1 at 2010-05-09 20:39:35:


我想知道克隆出错是怎么回事？能说一下具体怎么出错吗？谢谢了

pcr过程可以会出现概率很低的错配，万一你选择的克隆恰好是这个错配的，那么就会影响最终的结果。所以pcr产物直接测序反而更合适。
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11楼2010-05-09 21:57:42
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陈思容

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2010-05-09 21:50:11:
首先转录酶有很多种，虽然准确度很高，但是扩增产物多，即使是一亿分之一的出错率，也会有极少数碱基出错。
连接到载体上之后转化宿主，在宿主体内扩增的过程中，由一个拷贝增加到亿个拷贝，宿主的扩增系统会产生 ...

请问1000bp左右的PCR产物可直接测序，那么比较大的学列2000-7000bp的也可以P完后直接测吗
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12楼2010-05-10 12:34:05
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):欢迎多多交流~~ 2010-06-23 09:23:39
引用回帖:
Originally posted by 陈思容 at 2010-05-10 12:34:05:

请问1000bp左右的PCR产物可直接测序，那么比较大的学列2000-7000bp的也可以P完后直接测吗

首先1kb可能一个反应测不完，可能要依据第一个反应之后的序列来重新设计引物测序，这个是测序公司负责的，送测序时说好是测通就行。2-7kb肯定是要多个反应才能测通的，我没有送过这么长的PCR产物去测序，所以不知道，以下说一下我的看法，不一定对。

我送过柯斯质粒去测序，是3kb的载体与3.5kb的外源序列连接的产物，转化宿主后将宿主邮寄。测序公司可以培养宿主来提取质粒作为模板，只要提取质粒足够多，模板的量就可以保证。7kb的长度要测7-9个反应才能测通，所以可能可以直接测序，但要提供足够多的PCR产物才能测完，这个问一下测序公司怎么操作的就能得到很明确的答复。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
13楼2010-05-10 12:52:09
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xclj369ouc

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2010-05-09 16:35:39:
ITS不长，只要双向各一个反应就测出来了，每个反应的开头都不绝对准，尾部准，拼接之后得到准确的序列。相反，克隆过程中可能出错，可信度不高的，投稿的时候会被评阅人问的。

我直接送测一般都测不成功的，因为ITS多拷贝，扩增的产物无论如何纯化，总是多个模板的，测序时总出现双峰，或者是因为模板不纯峰图很乱，难以识别的。所以只能克隆测序，但是克隆测序太麻烦，不可能大批量测，所以不适合做群体遗传研究。
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14楼2010-06-20 13:43:04
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smallcat227

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
500bp左右，直接送测就行，要求高的话就连载体吧
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15楼2010-06-22 22:04:50
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主你好，我是做鱼类ITS的，我的情况是扩增出来的ITS序列不是单单一条序列，而是有多条序列，所以不能直接测序，而是需要单克隆再测序。而在真菌或者植物里面，这样的情况比较少见。不知道楼主是哪方面研究。欢迎多交流。
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
16楼2013-12-15 23:16:01
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王忆楠yn

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2010-05-09 16:35:39
ITS不长，只要双向各一个反应就测出来了，每个反应的开头都不绝对准，尾部准，拼接之后得到准确的序列。相反，克隆过程中可能出错，可信度不高的，投稿的时候会被评阅人问的。

求大神！我扩its序列有条带，但是测不出序列，这样会不会是因为模板DNA裂解掉了，扩cytb也是没有条带，模板放冰箱一年了。。。
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17楼2015-05-15 13:09:28
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
17楼: Originally posted by 王忆楠yn at 2015-05-15 13:09:28
求大神！我扩its序列有条带，但是测不出序列，这样会不会是因为模板DNA裂解掉了，扩cytb也是没有条带，模板放冰箱一年了。。。...

能不能上图
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18楼2015-05-15 22:04:36
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