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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】ITS测序
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xclj369ouc

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】ITS测序 已有13人参与

请教大家谁有测过ITS序列？
是直接PCR产物测序的，还是克隆测序的啊？
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1楼 2010-05-09 12:11:09
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冼亮淀粉酶

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amisking(金币+2):招版主！ 2010-05-09 13:34:26
我PCR产物不纯化就送去测序，测过超过20条序列。不过最好不要有干扰测序公司纯化的杂带，量也要达到他们的要求。
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2楼2010-05-09 13:17:17
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冼亮淀粉酶

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1949stone(金币+1):够热心 2010-05-09 17:33:42
ITS不长，只要双向各一个反应就测出来了，每个反应的开头都不绝对准，尾部准，拼接之后得到准确的序列。相反，克隆过程中可能出错，可信度不高的，投稿的时候会被评阅人问的。
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5楼2010-05-09 16:35:39
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冼亮淀粉酶

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reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-23 06:04:53
首先转录酶有很多种，虽然准确度很高，但是扩增产物多，即使是一亿分之一的出错率，也会有极少数碱基出错。
连接到载体上之后转化宿主，在宿主体内扩增的过程中，由一个拷贝增加到亿个拷贝，宿主的扩增系统会产生极少数碱基出错。
宿主邮寄到测序公司后进行扩增提取质粒，质粒又进行多次扩增，也可能出错。当然也可以用菌体PCR，不过难度明显比用质粒为模板高。

这下应该明白我为什么用PCR产物来测序了吧？
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10楼2010-05-09 21:50:11
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冼亮淀粉酶

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lstt09nk(金币+2):欢迎多多交流~~ 2010-06-23 09:23:39
引用回帖:
Originally posted by 陈思容 at 2010-05-10 12:34:05:

请问1000bp左右的PCR产物可直接测序，那么比较大的学列2000-7000bp的也可以P完后直接测吗

首先1kb可能一个反应测不完，可能要依据第一个反应之后的序列来重新设计引物测序，这个是测序公司负责的，送测序时说好是测通就行。2-7kb肯定是要多个反应才能测通的，我没有送过这么长的PCR产物去测序，所以不知道，以下说一下我的看法，不一定对。

我送过柯斯质粒去测序，是3kb的载体与3.5kb的外源序列连接的产物，转化宿主后将宿主邮寄。测序公司可以培养宿主来提取质粒作为模板，只要提取质粒足够多，模板的量就可以保证。7kb的长度要测7-9个反应才能测通，所以可能可以直接测序，但要提供足够多的PCR产物才能测完，这个问一下测序公司怎么操作的就能得到很明确的答复。
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13楼2010-05-10 12:52:09
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冼亮淀粉酶

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生物大分子降解酶
引用回帖:
17楼: Originally posted by 王忆楠yn at 2015-05-15 13:09:28
求大神！我扩its序列有条带，但是测不出序列，这样会不会是因为模板DNA裂解掉了，扩cytb也是没有条带，模板放冰箱一年了。。。...

能不能上图
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18楼2015-05-15 22:04:36
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