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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教不知道质粒信息的情况下，怎样设计引物来进行测序
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caiyouhua1983

金虫 (正式写手)

[交流] 请教不知道质粒信息的情况下，怎样设计引物来进行测序 已有4人参与

请教各位虫友，我有个菌里面有个质粒，试了各种常用的抗性（amp,kan,cm,ter等），都不能长，在对这个质粒信息一概不知的情况下，请问有没有什么较理想的办法，知道这个质粒的信息？怎样去设计测序引物，能不能从启动子和复制子这块下手？质粒的复制子序列都一样吗？多谢~！
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1楼 2013-03-16 11:32:12
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tianhome

木虫 (知名作家)
★
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把你发现的质粒纯化出来，理论上，可以根据启动子和复制子测序，但启动子和复制子序列不尽相同，可以试一下。那么你是怎么发现的这个质粒的呢，从这方面或许可以找到线索。
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caiyouhua1983
虫洞
2楼2013-03-17 03:41:25
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
质粒能提取出来吗？提质粒，酶切，连到测序载体，测序。
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3楼2013-03-17 08:56:44
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caiyouhua1983

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by XOooZzz at 2013-03-17 08:56:44
质粒能提取出来吗？提质粒，酶切，连到测序载体，测序。

感谢回复，质粒已经提取出来了，拷贝数很低，那是用单酶切，还是双酶切呢？能讲得具体点吗？
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正确对待别人，清醒对待自己！
4楼2013-03-17 11:03:13
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caiyouhua1983

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by tianhome at 2013-03-17 03:41:25
把你发现的质粒纯化出来，理论上，可以根据启动子和复制子测序，但启动子和复制子序列不尽相同，可以试一下。那么你是怎么发现的这个质粒的呢，从这方面或许可以找到线索。

表达载体的复制子序列，是有限的几种吗？是那几个序列？多谢！
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正确对待别人，清醒对待自己！
5楼2013-03-17 11:07:58
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
★
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提出质粒后。找几个酶切切看，出来片段的话就连到同样酶切的克隆载体上。用载体引物进行测序。
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6楼2013-03-17 14:07:28
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
4楼: Originally posted by caiyouhua1983 at 2013-03-17 11:03:13
感谢回复，质粒已经提取出来了，拷贝数很低，那是用单酶切，还是双酶切呢？能讲得具体点吗？...

都可以，片段太大的话双酶切。你先找一两个能切开目标质粒的酶，然后酶切连入测序载体测序。
考虑到你的目标质粒上可能有抑制感受态细菌生长、质粒复制的元件，最好能将质粒切成若干片段分别连接测序。当然，运气好的话一次连接测序就搞掂了。
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7楼2013-03-17 17:31:36
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dynamicren

木虫 (著名写手)
★
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估计你的是隐蔽质粒吧，对这个的研究我有过关注，通常是提取出来后，选一些常见的限制性内切酶进行酶切，然后再选一两个切得开的酶切回收后连入T载体测序。根据这部分测序所得的已知序列进行geneome walking测序，就行了。
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8楼2014-09-25 07:50:53
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