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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 转化感受态后提取质粒，测浓度总是很低
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hua_geduo

木虫 (正式写手)

[交流] 转化感受态后提取质粒，测浓度总是很低

年前做表达，目的片段连接到T载体上，然后转化，挑菌，摇菌，提取质粒，测质粒浓度总是很低；现在我的表达载体量不够了，想转化后提取，使量大一点，但是发现提取后测浓度又遇到同样的状况，请问这是怎么回事啊？用的感受态是DH5α，提质粒的试剂盒是爱思进的，实验卡在这里了，急求帮助！
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1楼 2013-03-19 09:48:17
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)
★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
表达载体比如pET系列， pGEX系列，提取质粒，浓度不高很正常啊，因为他们不是克隆载体，他们的启动子是严谨型启动子，要想获得大量质粒，你可以做中抽或大抽质粒，而且你转化表达菌株也不需要那么大的质粒浓度，只要转化表达菌株长出克隆出来就可以了
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8楼2013-03-19 12:25:36
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xuchenxi121

新虫 (初入文坛)
★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
通常不会是感受态的问题，而是提取质粒的问题，用试剂盒提取时很大可能会有质粒在柱子上洗脱不彻底的情况，因此建议可以将Elution加热后再洗脱，可显著提高得率。
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2楼2013-03-19 10:23:41
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玉米头

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励来分子生物版块发贴交流！ 2013-03-19 12:22:49
我也遇到过这种情况，质粒得率低，做了好多次都是这样，你可以换成JM109的，我试过，效果很好。这可能是DH5a不大适合T载体的扩增。
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3楼2013-03-19 10:31:14
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 很好的建议，鼓励交流哈！ 2013-03-19 12:26:44
是先划板活化后再挑菌放大摇菌是吗？
我以前用DH5a做宿主培养提取质粒也没问题的。
会不会是你的质粒拷贝数比较低？试着用低拷贝的质粒抽提试剂盒看看会不会好一些？
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4楼2013-03-19 10:52:35
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