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hua_geduo

木虫 (正式写手)


[交流] 转化感受态后提取质粒,测浓度总是很低

年前做表达,目的片段连接到T载体上,然后转化,挑菌,摇菌,提取质粒,测质粒浓度总是很低;现在我的表达载体量不够了,想转化后提取,使量大一点,但是发现提取后测浓度又遇到同样的状况,请问这是怎么回事啊?用的感受态是DH5α,提质粒的试剂盒是爱思进的,实验卡在这里了,急求帮助!
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)



hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
6楼: Originally posted by hua_geduo at 2013-03-19 11:50:41
T载体克隆提质粒已经做完了,现在在做表达载体质粒的提取...

表达载体一般不如克隆载体的拷贝数高,提质粒一般浓度会小一些。你可以多摇些菌。裂解时的溶液按菌量增加,上column吸附的时候可以用同一个柱子,按常规方法elute就可以了。
9楼2013-03-19 13:16:45
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xuchenxi121

新虫 (初入文坛)



hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
通常不会是感受态的问题,而是提取质粒的问题,用试剂盒提取时很大可能会有质粒在柱子上洗脱不彻底的情况,因此建议可以将Elution加热后再洗脱,可显著提高得率。
2楼2013-03-19 10:23:41
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玉米头

新虫 (初入文坛)


★ ★ ★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励来分子生物版块发贴交流! 2013-03-19 12:22:49
我也遇到过这种情况,质粒得率低,做了好多次都是这样,你可以换成JM109的,我试过,效果很好。这可能是DH5a不大适合T载体的扩增。
3楼2013-03-19 10:31:14
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sxxuan

金虫 (著名写手)


★ ★ ★
hua_geduo(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 很好的建议,鼓励交流哈! 2013-03-19 12:26:44
是先划板活化后再挑菌放大摇菌是吗?
我以前用DH5a做宿主培养提取质粒也没问题的。
会不会是你的质粒拷贝数比较低?试着用低拷贝的质粒抽提试剂盒看看会不会好一些?
4楼2013-03-19 10:52:35
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