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lipei98989

新虫 (小有名气)

[交流] 将目的基因连入表达质粒,酶切位点问题 已有3人参与

我第一次构建质粒表达载体,技术上遇到点小困难
质粒及酶切位点信息如图

http://bcs.duapp.com/emuchnet/20 ... _1376554762_926.jpg

把目的基因及质粒表达载体均双酶切,即想要切掉质粒NcoI(112)到PstI(902)那一段(这一段是个GFP),然后连上目的基因,NcoI(112)上有启动子,PstI(902)下有终止子,怎样达到这个目的呢?主要是NcoI在这个质粒上有三个位点,NcoI(112)(切点就是这个)、NcoI(3352)(在Cm抗性片段里,要保留)及NcoI(336)(在GFP中,顺带被切掉的,干扰性最大),应该怎么做呢?
将目的基因连入表达质粒,酶切位点问题
问题.jpg
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yimingwang

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流! 2013-08-15 20:14:10
这个是个技术活。。。最好换载体。
给你个2个方法,成不成就看你了。1。先PstI单酶切。纯化,然后NocI切30分钟。跑胶,切胶3.1K的带,但是不能切3.3K的带,跑个大胶时间跑长点。
方法二,(可行性更好),根据你需要的载体片断设计引物,直接PCR跑出来。然后和目的基因平末端连接。最后测序看插入方向就结束了。
Let'sdoit.
2楼2013-08-15 18:04:52
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
不要用酶切连接方法构建。这是最靠谱的方法。
3楼2013-08-15 20:32:15
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caoying辉

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你可以采用两次酶切
4楼2013-08-15 21:18:13
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