24小时热门版块排行榜

返回列表

lipei98989

新虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 691.7
散金: 26
红花: 1
帖子: 226
在线: 142.6小时
虫号: 1408821
注册: 2011-09-20
性别: GG
专业: 兽医免疫学

[交流] 将目的基因连入表达质粒，酶切位点问题已有3人参与

我第一次构建质粒表达载体，技术上遇到点小困难
质粒及酶切位点信息如图

http://bcs.duapp.com/emuchnet/20 ... _1376554762_926.jpg

把目的基因及质粒表达载体均双酶切，即想要切掉质粒NcoI(112)到PstI（902）那一段（这一段是个GFP），然后连上目的基因，NcoI(112)上有启动子，PstI（902）下有终止子，怎样达到这个目的呢？主要是NcoI在这个质粒上有三个位点，NcoI（112）（切点就是这个）、NcoI(3352)（在Cm抗性片段里，要保留）及NcoI（336）（在GFP中，顺带被切掉的，干扰性最大），应该怎么做呢？

问题.jpg

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

载体酶切位点与目的片段重复已经有13人回复
纠结的分子实验，双酶切连不上，求助已经有14人回复
目的基因连接表达载体的质粒PCR验证，结果出现2条带已经有10人回复
pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。已经有23人回复
目的基因连接到克隆载体后提取质粒测序，序列有问题已经有11人回复
表达载体连接好后测序问题已经有17人回复
质粒酶切切不动，质粒在宿主中繁衍酶切位点会突变么？已经有8人回复
双酶切粘性末端连接不上已经有21人回复
构建质粒时质粒上的ATG与目的基因ATG 的问题已经有4人回复
十万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序有结果，但反复说我质粒浓度很低已经有16人回复
请问用Vector NTI如何实现在pET28a中加入目的基因片段的谱图绘制。已经有10人回复
构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上已经有54人回复
如何从已知细胞中P出某个基因，并加上酶切位点？已经有8人回复
有谁知道关于Pfrt I 质粒的信息，包括他的基因序列和含有的酶切位点。急啊已经有4人回复
做酶切连接后转化再提质粒，质粒明显变小，Why??? 已经有24人回复
将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？已经有13人回复
克隆基因和载体连接后转化至大肠杆菌，为什么每次涂板都是空平板没有菌落？已经有17人回复
在基因重组过程中，怎样鉴别质粒载体是否被限制性内切酶切好？已经有10人回复
【求助/交流】质粒跟目的基因连接不上怎么办已经有17人回复

1楼 2013-08-15 16:54:06

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

yimingwang

金虫 (小有名气)

应助: 61 (初中生)
金币: 566.5
红花: 6
帖子: 142
在线: 32.9小时
虫号: 1192378
注册: 2011-01-19
性别: GG
专业: 植物保护生物技术

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！ 2013-08-15 20:14:10

这个是个技术活。。。最好换载体。
给你个2个方法，成不成就看你了。1。先PstI单酶切。纯化，然后NocI切30分钟。跑胶，切胶3.1K的带，但是不能切3.3K的带，跑个大胶时间跑长点。
方法二，（可行性更好），根据你需要的载体片断设计引物，直接PCR跑出来。然后和目的基因平末端连接。最后测序看插入方向就结束了。