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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建基因文库（sauA酶切后胶回收 效率低 该怎么办
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 构建基因文库（sauA酶切后胶回收 效率低 该怎么办

各位大侠：最近在构建基因文库，遇到一些问题,请各位帮忙解决一下啦
我用sauA不完全酶切基因组，得到合适范围的基因片段（2-6kb），再用试剂盒进行胶回收，发现胶回收效率很低，（附件是我回收前后基因片段大小的对比），上样量一样，但是回收后条带明显变得暗很多。
还有个问题：我回收的是2-6kb的片段，可回收后发现片段明显变小了，这是怎么回事？我该怎么调整我的实验方案？拜托各位了!
除了试剂盒回收，还有其他高效的回收方法吗？

回收前后对比（左：回收后；右：回收前）.jpg

[ Last edited by hraikeyan on 2012-11-16 at 23:08 ]
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nothing isimpossible
1楼 2012-11-16 23:04:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hraikeyan: 金币+3 2012-11-18 18:41:31
最好使用质量过硬的胶回收试剂盒。跑电泳时电压放低30-50伏，电压过高，带型分不开。2-6K的弥散带里掺杂小带没跑开。
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4楼2012-11-17 23:47:37
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普通回帖

凌宫雪

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不好意思，我不知道这是怎么回事，但是我在切胶前有带回收胶后就没有条带了，也好郁闷。。。
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SOFARSOGOOD!!!
2楼2012-11-16 23:55:44
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌宫雪 at 2012-11-16 23:55:44
不好意思，我不知道这是怎么回事，但是我在切胶前有带回收胶后就没有条带了，也好郁闷。。。

你是用试剂盒做的胶回收还是用其他方法做的？还有你切的胶大吗？我看有文献说切胶切的太大，也会影响回收效率。
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nothing isimpossible
3楼2012-11-17 17:23:39
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-11-17 23:47:37
最好使用质量过硬的胶回收试剂盒。跑电泳时电压放低30-50伏，电压过高，带型分不开。2-6K的弥散带里掺杂小带没跑开。

我们使用的是Qiaquick胶回收试剂盒，应该是挺好的了。我跑电泳时是选用最小的梳子，这样每个孔加的样很少，以至于很多孔才能上完所有的样，最后导致切胶的体积过大，以至于回收率低。我想下次跑胶时使用最大的梳子，这样可以减少胶体积。
还有一个问题：我回收的是200ulDNA溶液酶切结果，用三个柱子同时回收，是不是用的柱子太多了，这也影响柱效？sau3A Ⅰ酶用buffer做了十倍的稀释，存放在-20℃三四天还能用吗？
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nothing isimpossible
5楼2012-11-18 14:12:15
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-19 13:48:08
引用回帖:
5楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-11-18 14:12:15
我们使用的是Qiaquick胶回收试剂盒，应该是挺好的了。我跑电泳时是选用最小的梳子，这样每个孔加的样很少，以至于很多孔才能上完所有的样，最后导致切胶的体积过大，以至于回收率低。我想下次跑胶时使用最大的梳子 ...

当然是用宽梳子了，或者用胶带粘起来。用一个柱子就可以了，溶胶了，反复上，就可以，你可以看下每个柱子有最大DNA结合量，一般不会超载.sau3A Ⅰ酶我们一般现用现配.
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6楼2012-11-18 21:13:06
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zg1415

金虫 (正式写手)
用大批量做比如，20微升的体系，可以多组一些，一起回收，然后用好的试剂盒回收
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一直被模仿，从未被超越
7楼2012-11-19 16:52:13
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desheng101

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hraikeyan: 金币+1 2012-11-19 21:13:47
胶的大小肯定会影响回收效率哦，建议20微升体系的，回收2个一起回收。
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8楼2012-11-19 17:27:50
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zg1415 at 2012-11-19 16:52:13
用大批量做比如，20微升的体系，可以多组一些，一起回收，然后用好的试剂盒回收

我是大批量的做的，20ul体系，做了10管，但是跑胶的时候是每管上一个空，这样导致切的胶体积过大，所以可能回收效率低。
请问：为什么我切的是2-6kb的，可是胶回收后片段变小了，大部分集中在2kb以下。像我这种总共200ul的酶切量，用几个柱子回收较好？
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nothing isimpossible
9楼2012-11-19 21:09:58
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by desheng101 at 2012-11-19 17:27:50
胶的大小肯定会影响回收效率哦，建议20微升体系的，回收2个一起回收。

您建过文库吗？我用20ul的体系，总共做了10管，这些量构建一个7000左右的克隆子的文库吗？
做10管，需要几个柱子回收？
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nothing isimpossible
10楼2012-11-19 21:13:40
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