| 查看: 2900 | 回复: 19 | ||
[求助]
克隆做不出来，求帮助
|
||
|
做克隆一个月了，始终有两个做不出来。都是大约2000bp的长度。 1.载体：pFASTbac-gp67 感受态：DH5a 用BamHI和XhoI双酶切 酶切37度，4小时 连接有时候过夜连，菌落很少，而且菌液pcr P不出来。 2.载体：pFASTbac-Hem 感受态：DH5a 用BglII和XhoI双酶切 酶切37度，4小时 连接有时候过夜连，菌落很少，而且菌液pcr P不出来 酶切体系：回收片段43ul 酶1.2各1ul buffer 5ul BSA 0.5ul 连接体系：回收酶切产物 12ul T4连接酶1ul buffer 1.5ul 载体 0.5ul |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有165人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 请教一下，这是否为假阳性克隆的问题，如果是，该如何提高阳性克隆效率？
已经有20人回复
- 酶切酶连转化后单克隆检测不对
已经有8人回复
- 如何根据保守序列将基因片段克隆出来
已经有16人回复
- 挑单克隆后，菌液PCR检测所有条带都偏小，目的条带没有出现
已经有9人回复
- 求助：亚克隆做不出来
已经有5人回复
- 构建克隆载体时出现的问题
已经有11人回复
- 平末端连接做不出来克隆
已经有30人回复
- overlap PCR做不出来呐。。。。
已经有23人回复
- 克隆过程出现的问题
已经有7人回复
- PCR高手请进，小女子有事相求，我刚来金币不要嫌少啊，我只有这么多啊，全给你了
已经有20人回复
- TA克隆遇到的问题
已经有10人回复
- DNA测序求助
已经有12人回复
- 【求助/交流】基因功能验证
已经有8人回复
- 【求助/交流】怎么做都提不出DNA，请高手帮一下忙喽！！！！
已经有52人回复
- 【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体
已经有26人回复
- 【求助/交流】WB老做不出来
已经有6人回复
- 【求助/交流】急！克隆快做了一个月了，就是做不出来
已经有24人回复
- 【求助/交流】基因克隆时，酶切有结果，PCR却P不出来
已经有11人回复
- 【求助/交流】5'Race反复做不出来，该怎么办
已经有74人回复
- 【求助/交流】PCR产物切胶回收后可不可以加A尾,做TA克隆，急！希望高手们能帮帮忙！
已经有9人回复
- 【求助/交流】TA克隆为什么会长出蓝斑
已经有4人回复
- 【求助/交流】长片段的连接转化
已经有9人回复
raindick1231
铜虫 (小有名气)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 93.3
- 帖子: 83
- 在线: 26.5小时
- 虫号: 649284
- 注册: 2008-11-08
- 性别: GG
- 专业: 植物学研究的新技术、新方
2楼2013-01-23 19:56:24
raindick1231
铜虫 (小有名气)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 93.3
- 帖子: 83
- 在线: 26.5小时
- 虫号: 649284
- 注册: 2008-11-08
- 性别: GG
- 专业: 植物学研究的新技术、新方
3楼2013-01-23 20:08:21
酶切专家
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 2
- 应助: 96 (初中生)
- 金币: 1610.8
- 红花: 4
- 帖子: 149
- 在线: 41.3小时
- 虫号: 1648414
- 注册: 2012-02-27
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 果然是专家 2013-01-29 08:35:44
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 果然是专家 2013-01-29 08:35:44
|
克隆时一般需要设置一个载体自连对照，用于分析载体本身是否酶切完全。 还需要明确感受态细胞是否正常。 如果载体或外源片段酶切不完全，也会导致克隆失败，建议你用double digestion designer设计双酶切，以确保载体和你的目的基因片段酶切完全，提高克隆效率，减少假阳性背景克隆。 如果都正常，那就要考虑是否克隆的基因对大肠杆菌有毒性（基因水平或蛋白质水平）。由于毒性的原因，对导致很多基因在原核表达载体上克隆不成功。 祝好运！ |
4楼2013-01-23 22:01:09
5楼2013-01-24 13:45:12
6楼2013-01-24 13:46:27
感谢参与，应助指数 +1
|
本帖内容被屏蔽 |
7楼2013-01-24 15:27:35
8楼2013-01-24 15:44:06
9楼2013-01-24 17:26:10
10楼2013-01-24 17:26:24
