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克隆做不出来，求帮助
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做克隆一个月了，始终有两个做不出来。都是大约2000bp的长度。 1.载体：pFASTbac-gp67 感受态：DH5a 用BamHI和XhoI双酶切 酶切37度，4小时 连接有时候过夜连，菌落很少，而且菌液pcr P不出来。 2.载体：pFASTbac-Hem 感受态：DH5a 用BglII和XhoI双酶切 酶切37度，4小时 连接有时候过夜连，菌落很少，而且菌液pcr P不出来 酶切体系：回收片段43ul 酶1.2各1ul buffer 5ul BSA 0.5ul 连接体系：回收酶切产物 12ul T4连接酶1ul buffer 1.5ul 载体 0.5ul |
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【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+3, 果然是专家 2013-01-29 08:35:44
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kx444555: 金币+3, 果然是专家 2013-01-29 08:35:44
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克隆时一般需要设置一个载体自连对照，用于分析载体本身是否酶切完全。 还需要明确感受态细胞是否正常。 如果载体或外源片段酶切不完全，也会导致克隆失败，建议你用double digestion designer设计双酶切，以确保载体和你的目的基因片段酶切完全，提高克隆效率，减少假阳性背景克隆。 如果都正常，那就要考虑是否克隆的基因对大肠杆菌有毒性（基因水平或蛋白质水平）。由于毒性的原因，对导致很多基因在原核表达载体上克隆不成功。 祝好运！ |
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