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yishu2012

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专业: 发育生物学

[求助] 克隆做不出来，求帮助

做克隆一个月了，始终有两个做不出来。都是大约2000bp的长度。
1.载体：pFASTbac-gp67
感受态：DH5a
用BamHI和XhoI双酶切
酶切37度，4小时
连接有时候过夜连，菌落很少，而且菌液pcr P不出来。
2.载体：pFASTbac-Hem
感受态：DH5a
用BglII和XhoI双酶切
酶切37度，4小时
连接有时候过夜连，菌落很少，而且菌液pcr P不出来
酶切体系：回收片段43ul 酶1.2各1ul buffer 5ul BSA 0.5ul
连接体系：回收酶切产物 12ul T4连接酶1ul buffer 1.5ul 载体 0.5ul

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1楼 2013-01-23 16:04:36

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yishu2012

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引用回帖:

3楼: Originally posted by raindick1231 at 2013-01-23 20:08:21
有一次华大基因给我合成错了让我挨了多少骂。。。。我一年都没在那合引物...

引物检查过了，完全没有问题！

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5楼2013-01-24 13:45:12

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yishu2012

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引用回帖:

4楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-01-23 22:01:09
克隆时一般需要设置一个载体自连对照，用于分析载体本身是否酶切完全。
还需要明确感受态细胞是否正常。
如果载体或外源片段酶切不完全，也会导致克隆失败，建议你用double digestion designer设计双酶切，以确保 ...

谢谢了，关键问题在于我那个比较奇怪，因为同样的片段也有连别的载体，都是没问题的，但是连这个载体就不行了

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6楼2013-01-24 13:46:27

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