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yishu2012

金虫 (小有名气)

[求助] 克隆做不出来，求帮助

做克隆一个月了，始终有两个做不出来。都是大约2000bp的长度。
1.载体：pFASTbac-gp67
   感受态：DH5a
   用BamHI和XhoI双酶切
   酶切37度，4小时
   连接有时候过夜连，菌落很少，而且菌液pcr P不出来。
2.载体：pFASTbac-Hem
感受态：DH5a
   用BglII和XhoI双酶切
   酶切37度，4小时
   连接有时候过夜连，菌落很少，而且菌液pcr P不出来
酶切体系：回收片段43ul  酶1.2各1ul buffer 5ul BSA 0.5ul
连接体系：回收酶切产物 12ul T4连接酶1ul buffer 1.5ul 载体 0.5ul
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1楼2013-01-23 16:04:36
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yishu2012

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-01-23 22:01:09
克隆时一般需要设置一个载体自连对照，用于分析载体本身是否酶切完全。
还需要明确感受态细胞是否正常。
如果载体或外源片段酶切不完全，也会导致克隆失败，建议你用double digestion designer设计双酶切，以确保 ...

谢谢了，关键问题在于我那个比较奇怪，因为同样的片段也有连别的载体，都是没问题的，但是连这个载体就不行了
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6楼2013-01-24 13:46:27
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raindick1231

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
检查引物 合成对不对
先克隆到T载体上
然后不是要测序
顺便看看没且位点对不对
大概会多花2-3天时间，不过实验能成功就成
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2楼2013-01-23 19:56:24
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raindick1231

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by raindick1231 at 2013-01-23 19:56:24
检查引物 合成对不对
先克隆到T载体上
然后不是要测序
顺便看看没且位点对不对
大概会多花2-3天时间，不过实验能成功就成

有一次华大基因给我合成错了 让我挨了多少骂。。。。我一年都没在那合引物
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2013-01-23 20:08:21
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 果然是专家 2013-01-29 08:35:44
克隆时一般需要设置一个载体自连对照，用于分析载体本身是否酶切完全。
还需要明确感受态细胞是否正常。
如果载体或外源片段酶切不完全，也会导致克隆失败，建议你用double digestion designer设计双酶切，以确保载体和你的目的基因片段酶切完全，提高克隆效率，减少假阳性背景克隆。
如果都正常，那就要考虑是否克隆的基因对大肠杆菌有毒性（基因水平或蛋白质水平）。由于毒性的原因，对导致很多基因在原核表达载体上克隆不成功。

祝好运！
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4楼2013-01-23 22:01:09
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