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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2026级博士研究生招生报考通知(长期有效)
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raindick1231

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-01-23 22:01:09
克隆时一般需要设置一个载体自连对照,用于分析载体本身是否酶切完全。
还需要明确感受态细胞是否正常。
如果载体或外源片段酶切不完全,也会导致克隆失败,建议你用double digestion designer设计双酶切,以确保 ...

不是引物设计 是指合成的有问题哦
11楼2013-01-24 17:54:01
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by yishu2012 at 2013-01-24 17:26:10
那个连接体系是什么啦?...

不知道。似乎是增加连接酶量,加peg,延长连接时间等。所以一般避免用这样的酶。
12楼2013-01-25 08:20:29
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xinmiao94

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

13楼2013-01-25 15:20:00
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raindick1231

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是不是载体的酶切位点坏了?别的片段用过这两个酶吗?
14楼2013-01-26 21:15:21
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cxt86

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

LZ如果是两个载体都遇到同样的情况,那可能要从两个载体操作的共同环节入手找问题。两个目的片段都是2000bp有没有可能质粒太大不能在DH5a里扩增?或者DH5a出了问题?两个载体都用到了XhoI,酶切体系是不是对XhoI不适合?热激温度是不是准确?培养基及抗性有没有问题?一步一步排查吧
祝顺利
15楼2013-01-27 03:45:16
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jasminezhao

金虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by yishu2012 at 2013-01-24 17:26:24
比例应该是多少...

完了,一看你问这话就知道你的连接体系可定有问题的,一般vector:insert 在1:3~10,注意是摩尔比而不是体积比!
16楼2013-01-28 09:46:20
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-29 08:36:29
先用这几个酶 单独切切载体看看吧
以前我也用过xhoi 和bglii
实际上这些酶做链接都没什么问题,就是能不能在引物都没有什么问题的情况下连接成功了
以前我用bglii切载体老是会有一些杂带,但是主带还是很明显,但是回收之后死活连不上,到最后我直接换了一个酶切位点,换了一条引物,
两个酶切之后载体切得就一条带,没有任何杂带,做链接,一次就能成功
17楼2013-01-29 07:07:32
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addy0612

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

如果酶切位点,序列,酶切buffer都没有问题的话,检查酶切是否已经切开,可以两个酶分别加入体系中,难切的先加,容易切的后加,然后跑电泳验证一下;另外,有时候菌落pcr是验证不出来的,这个时候可以考虑摇菌,重新抽质粒,用质粒做模板pcr,或者再双酶切质粒,以达到验证的效果。祝实验顺利!
18楼2013-01-29 08:41:51
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小小平凡

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也出现过这样的问题,将载体凝胶电泳后发现条带亮度很弱,是载体浓度不够。你可以将载体跑个电泳试试。
19楼2013-05-05 21:54:03
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意孤城_

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

菌液PCR P不出来不代表你的片段没插进去(引物不特意就P不出来),还是要提质粒酶切鉴定才靠谱。因为你用了同尾酶进行连接,所以酶切鉴定就不能用BgLII和BamHI了,在附近再选一个,用XhoI和另外一个切, 看看大小对不对就行了。毕竟你的菌长起来了
20楼2013-05-06 11:42:36
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