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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆做不出来，求帮助
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raindick1231

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-01-23 22:01:09
克隆时一般需要设置一个载体自连对照，用于分析载体本身是否酶切完全。
还需要明确感受态细胞是否正常。
如果载体或外源片段酶切不完全，也会导致克隆失败，建议你用double digestion designer设计双酶切，以确保 ...

不是引物设计 是指合成的有问题哦
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11楼2013-01-24 17:54:01
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yishu2012 at 2013-01-24 17:26:10
那个连接体系是什么啦？...

不知道。似乎是增加连接酶量，加peg，延长连接时间等。所以一般避免用这样的酶。
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12楼2013-01-25 08:20:29
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xinmiao94

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
13楼2013-01-25 15:20:00
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raindick1231

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是不是载体的酶切位点坏了？别的片段用过这两个酶吗？
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14楼2013-01-26 21:15:21
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cxt86

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

LZ如果是两个载体都遇到同样的情况，那可能要从两个载体操作的共同环节入手找问题。两个目的片段都是2000bp有没有可能质粒太大不能在DH5a里扩增？或者DH5a出了问题？两个载体都用到了XhoI，酶切体系是不是对XhoI不适合？热激温度是不是准确？培养基及抗性有没有问题？一步一步排查吧
祝顺利
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15楼2013-01-27 03:45:16
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jasminezhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by yishu2012 at 2013-01-24 17:26:24
比例应该是多少...

完了，一看你问这话就知道你的连接体系可定有问题的，一般vector：insert 在1：3~10，注意是摩尔比而不是体积比！
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16楼2013-01-28 09:46:20
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xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-29 08:36:29
先用这几个酶 单独切切载体看看吧
以前我也用过xhoi 和bglii
实际上这些酶做链接都没什么问题，就是能不能在引物都没有什么问题的情况下连接成功了
以前我用bglii切载体老是会有一些杂带，但是主带还是很明显，但是回收之后死活连不上，到最后我直接换了一个酶切位点，换了一条引物，
两个酶切之后载体切得就一条带，没有任何杂带，做链接，一次就能成功
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17楼2013-01-29 07:07:32
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addy0612

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

如果酶切位点，序列，酶切buffer都没有问题的话，检查酶切是否已经切开，可以两个酶分别加入体系中，难切的先加，容易切的后加，然后跑电泳验证一下；另外，有时候菌落pcr是验证不出来的，这个时候可以考虑摇菌，重新抽质粒，用质粒做模板pcr，或者再双酶切质粒，以达到验证的效果。祝实验顺利！
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18楼2013-01-29 08:41:51
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小小平凡

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也出现过这样的问题，将载体凝胶电泳后发现条带亮度很弱，是载体浓度不够。你可以将载体跑个电泳试试。
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19楼2013-05-05 21:54:03
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意孤城_

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

菌液PCR P不出来不代表你的片段没插进去（引物不特意就P不出来），还是要提质粒酶切鉴定才靠谱。因为你用了同尾酶进行连接，所以酶切鉴定就不能用BgLII和BamHI了，在附近再选一个，用XhoI和另外一个切， 看看大小对不对就行了。毕竟你的菌长起来了
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20楼2013-05-06 11:42:36
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