24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

yishu2012

金虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 990.3
散金: 200
红花: 3
帖子: 199
在线: 137.9小时
虫号: 1671533
注册: 2012-03-07
性别: MM
专业: 发育生物学

[求助] 克隆做不出来，求帮助

做克隆一个月了，始终有两个做不出来。都是大约2000bp的长度。
1.载体：pFASTbac-gp67
感受态：DH5a
用BamHI和XhoI双酶切
酶切37度，4小时
连接有时候过夜连，菌落很少，而且菌液pcr P不出来。
2.载体：pFASTbac-Hem
感受态：DH5a
用BglII和XhoI双酶切
酶切37度，4小时
连接有时候过夜连，菌落很少，而且菌液pcr P不出来
酶切体系：回收片段43ul 酶1.2各1ul buffer 5ul BSA 0.5ul
连接体系：回收酶切产物 12ul T4连接酶1ul buffer 1.5ul 载体 0.5ul

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

请教一下，这是否为假阳性克隆的问题，如果是，该如何提高阳性克隆效率？已经有20人回复
酶切酶连转化后单克隆检测不对已经有8人回复
如何根据保守序列将基因片段克隆出来已经有16人回复
挑单克隆后，菌液PCR检测所有条带都偏小，目的条带没有出现已经有9人回复
求助：亚克隆做不出来已经有5人回复
构建克隆载体时出现的问题已经有11人回复
平末端连接做不出来克隆已经有30人回复
overlap PCR做不出来呐。。。。已经有23人回复
克隆过程出现的问题已经有7人回复
PCR高手请进，小女子有事相求，我刚来金币不要嫌少啊，我只有这么多啊，全给你了已经有20人回复
TA克隆遇到的问题已经有10人回复
DNA测序求助已经有12人回复
【求助/交流】基因功能验证已经有8人回复
【求助/交流】怎么做都提不出DNA，请高手帮一下忙喽！！！！已经有52人回复
【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体已经有26人回复
【求助/交流】WB老做不出来已经有6人回复
【求助/交流】急！克隆快做了一个月了，就是做不出来已经有24人回复
【求助/交流】基因克隆时，酶切有结果，PCR却P不出来已经有11人回复
【求助/交流】5'Race反复做不出来，该怎么办已经有74人回复
【求助/交流】PCR产物切胶回收后可不可以加A尾,做TA克隆，急！希望高手们能帮帮忙！已经有9人回复
【求助/交流】TA克隆为什么会长出蓝斑已经有4人回复
【求助/交流】长片段的连接转化已经有9人回复

1楼 2013-01-23 16:04:36

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

xiaoweiwei121

荣誉版主 (文坛精英)

这潭水蓝的深邃

MolEPI: 5
应助: 18 (小学生)
贵宾: 39.097
金币: 106416
散金: 2773
红花: 197
沙发: 109
帖子: 35580
在线: 2157.8小时
虫号: 426591
注册: 2007-07-28
性别: MM
专业: 蛋白质组学
管辖: 虫友互识

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-29 08:36:29

先用这几个酶单独切切载体看看吧
以前我也用过xhoi 和bglii
实际上这些酶做链接都没什么问题，就是能不能在引物都没有什么问题的情况下连接成功了
以前我用bglii切载体老是会有一些杂带，但是主带还是很明显，但是回收之后死活连不上，到最后我直接换了一个酶切位点，换了一条引物，
两个酶切之后载体切得就一条带，没有任何杂带，做链接，一次就能成功

赞一下

回复此楼

17楼2013-01-29 07:07:32

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

相关版块跳转我要订阅楼主 yishu2012 的主题更新

返回列表