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yishu2012

金虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 990.3
散金: 200
红花: 3
帖子: 199
在线: 137.9小时
虫号: 1671533
注册: 2012-03-07
性别: MM
专业: 发育生物学

[求助] 克隆做不出来，求帮助

做克隆一个月了，始终有两个做不出来。都是大约2000bp的长度。
1.载体：pFASTbac-gp67
感受态：DH5a
用BamHI和XhoI双酶切
酶切37度，4小时
连接有时候过夜连，菌落很少，而且菌液pcr P不出来。
2.载体：pFASTbac-Hem
感受态：DH5a
用BglII和XhoI双酶切
酶切37度，4小时
连接有时候过夜连，菌落很少，而且菌液pcr P不出来
酶切体系：回收片段43ul 酶1.2各1ul buffer 5ul BSA 0.5ul
连接体系：回收酶切产物 12ul T4连接酶1ul buffer 1.5ul 载体 0.5ul

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1楼2013-01-23 16:04:36

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cxt86

金虫 (小有名气)

应助: 8 (幼儿园)
金币: 1071.9
帖子: 135
在线: 100小时
虫号: 1018808
注册: 2010-05-14
专业: 生物物理、生物化学与分子

【答案】应助回帖

LZ如果是两个载体都遇到同样的情况，那可能要从两个载体操作的共同环节入手找问题。两个目的片段都是2000bp有没有可能质粒太大不能在DH5a里扩增？或者DH5a出了问题？两个载体都用到了XhoI，酶切体系是不是对XhoI不适合？热激温度是不是准确？培养基及抗性有没有问题？一步一步排查吧

祝顺利

15楼2013-01-27 03:45:16

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