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xm_liu

铁虫 (初入文坛)

[求助] 基因组DNA 酶切后条带不清晰，什么原因啊？ 已有6人参与

各位虫友，我提取的腺病毒基因组DNA，用Fsp I 酶切后条带很不清晰，不知道是什么原因，酶切体系是50ul，其中酶2ul，泳道1是marker，泳道2 是其他样品，泳道3 的DNA 是10ug，泳道4  20ug，泳道5 40ug，37℃，酶切过夜，约17h，谢谢大家了！

基因组DNA 酶切后条带不清晰，什么原因啊？
IMG_20140822_122802.jpg
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1楼 2014-08-22 14:41:04
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xm_liu(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-22 20:56:29
我做过用双酶切切基因组的  是一片弥散的条带
但没做过用单酶切的 而且病毒没研究过
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2楼2014-08-22 15:17:31
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xm_liu(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-22 20:56:41
1，从你的图中可以看出，样品DNA序列中可能有多个酶切位点，因此切出几条弱带及弥散。
2，其次，这个酶酶切的时间需要根据要求设定，普通酶切一般45分钟到2个小时足够了，你的样品过夜酶切，不晓得温度是否会对你的样品造成降解。
3，酶切样品为什么用不同浓度？根据酶的说明书来配比酶切体系和样品DNA即可哈。
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3楼2014-08-22 17:28:40
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xm_liu

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2014-08-22 17:28:40
1，从你的图中可以看出，样品DNA序列中可能有多个酶切位点，因此切出几条弱带及弥散。
2，其次，这个酶酶切的时间需要根据要求设定，普通酶切一般45分钟到2个小时足够了，你的样品过夜酶切，不晓得温度是否会对你的 ...

1、理论上应该切出13条带，也不应该是这么弱的或者弥散的呀；
2、切的是基因组DNA，不是质粒载体，不知道会不会切不完全，依你看这个结果有可能是DNA降解造成的吗？
3、根据酶的说明书，30ul体系用1000ngDNA，实际电泳效果不好，条带非常弱，不清晰，所以做了梯度
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4楼2014-08-23 15:51:32
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
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xm_liu: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2014-08-26 16:24:12
你的上样量不到10 μg吧。有些酶不能酶切甲基化的酶切位点。
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5楼2014-08-24 10:18:14
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trizol11

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-26 21:25:23
酶切2个小时就已经可以了，时间久会导致片段降解和酶活性下降，你过夜酶切的话酶的活性已经丧失了，你试一下2小时酶切。10微升体系，计算一下酶和载体的摩尔体积，确定没得量和载体的量。
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任重道远……
6楼2014-08-24 11:18:08
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令狐少陈

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-26 21:25:36
我也遇到过类似的问题。
我建议你酶切时间少一点。切到6h左右取10ul跑一下，不行就继续切，行就全跑了。 那么抹，估计切久了吧。还有你基因组有没跑下啊？质量怎么样
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多多交流，海纳百川
7楼2014-08-24 11:28:15
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-26 21:25:47
引用回帖:
4楼: Originally posted by xm_liu at 2014-08-23 15:51:32
1、理论上应该切出13条带，也不应该是这么弱的或者弥散的呀；
2、切的是基因组DNA，不是质粒载体，不知道会不会切不完全，依你看这个结果有可能是DNA降解造成的吗？
3、根据酶的说明书，30ul体系用1000ngDNA，实 ...

弥散有几种可能，1，最开始提取的基因组DNA就有降解，这样的话无论你怎么切都会是弥散的。2，酶切在37度下的时间过长导致降解，可做两个实验对比一下排除这种可能。3，用其他公司的酶和你现在用的酶做个对比确定现在用的酶是没有问题的（我也遇到过类似现象即酶切带太弱，原因可能是公司为了赚钱把原装酶液稀释了或卖的是快过期的酶）。
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8楼2014-08-24 11:30:41
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leonaliu2013

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人认为酶切时间过长

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2014-08-24 11:35:43
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xm_liu

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-08-24 10:18:14
你的上样量不到10 μg吧。有些酶不能酶切甲基化的酶切位点。

确实不到10ug，50ul酶切体系用的10ug的DNA，上样量是20ul，也就是上样量大概是4ug，用的是11个孔的梳子，应该是最小的孔了
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10楼2014-08-26 16:23:02
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