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pandashu1988

铁虫 (初入文坛)

[求助] 跑电泳的一点小疑问

跑电泳时点样先加buffer还是DNA样本？
师兄说最好是把凝胶放在缓冲液里面点样，有什么好处？

下面是小生酶切DNA后跑电泳的图，先buffer后DNA，从右往左点样的，为什么buffer的带子右边的会比左边的跑的更前呢？还有大神们能看看哪个孔跑的片段更接近300~900bp,还是看不出来？额~
跑电泳的一点小疑问
jh 2013-07-03 19 小时 24 分钟_副本.jpg
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1楼2013-07-03 20:15:08
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yilunanxia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-07-04 10:33:51
1949stone: 回帖置顶 2013-07-04 10:37:10
跑电泳时点样时是先将DNA模板与loading buffer混合再加样。
师兄说最好是把凝胶放在缓冲液里面点样，是因为loading buffer的一个作用是使DNA在液体中沉降到底部。如果不在缓冲溶液里，那loading buffer的沉降作用就无法体现。
我不确定你这些是不是一种样，但是可以肯定的是你的样本都朝着一个方向倾斜，不确定是你的电泳槽的问题还是你把胶放在电泳槽一侧的原因导致的。
至于片段大小无法判断，因为你的marker的各个条带大小都不确定。
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7楼2013-07-04 10:17:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-04 02:57:59
我觉得你的问题很怪，电泳上样buffer和样品是要混合起来的，顺序只是方便操作的问题。一般都是先buffer，可以用一个枪头去吸，然后加入样品，因为枪头上带了样品，不能反复使用造成污染。没有缓冲液的样品孔里是空气，首先这对胶不好，容易干掉。其次，点样时如果在缓冲液里样品可以加在液体里会直接沉到样品孔的底部。所有的凝胶电泳都是这样做的。
至于你的电泳图，我觉得胶做得不行或者电泳条件有问题。marker都跑歪了，而且条带不清晰。
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3楼2013-07-03 23:39:15
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普通回帖

pandashu1988

铁虫 (初入文坛)
用的是2000的MARKER
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2楼2013-07-03 20:16:22
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pandashu1988

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 23:39:15
我觉得你的问题很怪，电泳上样buffer和样品是要混合起来的，顺序只是方便操作的问题。一般都是先buffer，可以用一个枪头去吸，然后加入样品，因为枪头上带了样品，不能反复使用造成污染。没有缓冲液的样品孔里是空气 ...

嗯，多谢解答，嘿嘿~我还想问下，泡成这样看不清，是不是DNA总量也不够，切开了也看不清？
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4楼2013-07-04 08:47:02
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-04 10:33:43
在电泳液加就可以啊 buffer有沉降的作用
@cicelyzh  的意见很中肯
你的mark跑的有点问题 但是起码条带跑开了 分离度也行  但是你的酶切样本 说句难听的 一塌糊涂 没有您所谓片段 需要重新设计下试验 慢慢摸索下
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pandashu1988
海纳百川止于至善
5楼2013-07-04 09:42:56
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幽魂银龙

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先加样时应该把buffer和DNA混匀再加，再者我觉得你的DNA有问题，没有专一性，建议把PCR产物重新跑一次，如果还是这样得重新PCR啊，这没有你要的目的基因
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6楼2013-07-04 10:05:17
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pandashu1988

铁虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 1949stone at 2013-07-04 09:42:56
在电泳液加就可以啊 buffer有沉降的作用
cicelyzh  的意见很中肯
你的mark跑的有点问题 但是起码条带跑开了 分离度也行  但是你的酶切样本 说句难听的 一塌糊涂 没有您所谓片段 需要重新设计下试验 慢慢摸索下...

这个图是提取某步甲总DNA之后割胶回收在酶切的。
之前没有割胶回收直接酶切可以看到中间有很亮的条带，但是又去提取的DNA有拖带现象，所以先做了割胶，之后再酶切反而是这个样子。。。所以应该和样本没关系吧，额~
还有请教下，用的酶是TAKARA的SAU3AI， ①说明书上提到的20ul反应体系是1ul酶配1ug的DNA； ②上面的1U活性单位定义是37度50ul体系里将1ug λDNA完全分解的量。 ③到手的管子上标的酶浓度是10U/ul，那么是不是要将酶稀释10倍了再加？
还有我看论坛里都说这个酶的最适浓度是0.01U/ug，这个说明书上的定义岂不是有矛盾，额~
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8楼2013-07-04 14:26:28
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pandashu1988

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 幽魂银龙 at 2013-07-04 10:05:17
首先加样时应该把buffer和DNA混匀再加，再者我觉得你的DNA有问题，没有专一性，建议把PCR产物重新跑一次，如果还是这样得重新PCR啊，这没有你要的目的基因

，这个不是PCR产物，是直接提取总DNA割胶回收后酶切的，因为电泳检测看到有拖带~但是没有割胶回收直接把总DNA酶切的话就能在想要的片段大小那里看到明亮条带。。。所以很纠结，难道是DNA量不够，打算把回收的DNA P一下再来酶切看看
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9楼2013-07-04 14:29:56
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grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by pandashu1988 at 2013-07-04 08:47:02
嗯，多谢解答，嘿嘿~我还想问下，泡成这样看不清，是不是DNA总量也不够，切开了也看不清？...

你这个DNA切开了也不可能出现特异的条带阿! 我觉得DNA切出来就是这个样子的，各种大小的片段都有啊，你要是切的久一点，整个带会向下偏移，但是我还没见到过直接就酶切DNA然后看到条带的。
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10楼2013-07-04 14:43:12
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