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myitcat

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR后跑电泳,整个泳道都很亮,怎么回事?

模板是基因组,目的是克隆一个基因的promoter,片段长度3K,以前克隆的时候能够得到目的条带。但是我最近重提了基因组以后突然就克隆不出来了,换回原来的基因组作为模板得到的条带也是如图所示的。有人考虑到模板或者引物反复冻融次数太多,但是我重新稀释了引物,模板也是分装好的,取了新的,体系和反应条件都没换,结果就是这样。
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09丁于飞

银虫 (初入文坛)

以前遇到过这种情况,结果很出乎意料,是跑胶出了问题,TAE有问题,导致PCR产物跑不出,但是提取的模板和MARKER能够跑出来。不知道你这个会不会是类似问题,或许可以试试。
2楼2012-08-10 09:54:48
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chenguestc

木虫 (职业作家)

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★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-10 13:53:49
1,模板浓度太高。
2,引物浓度太高。
3,镁离子浓度太高。
如果确定上述3个没有问题,就只有重提DNA,我以前也遇到过类似现象,重提DNA后就好了,或许DNA质量对你的引物影响太大,或者引物特异性没有那么高或对DNA质量敏感。
3楼2012-08-10 12:40:24
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linqin1029

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
基本可以确定为模板浓度太高,先将模板进行定量。然后稀释其浓度为50~100ng取1ul进行PCR.再跑电泳看看结果!
4楼2012-08-10 12:49:01
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jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的Marker跑的很好,我感觉应该不是胶的问题,可能是引物或模板的问题,这个不太确定
5楼2012-08-10 12:50:26
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丸子龙

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-12 15:45:23
我和你的情况一模一样,经过分析,是我的上游引物错了。用新合成的上游引物重新pcr出来了正确的目的条带。所以建议你分析引物和模板的序列正确性。
6楼2012-10-12 15:10:03
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