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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR后跑电泳，整个泳道都很亮，怎么回事？
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myitcat

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR后跑电泳，整个泳道都很亮，怎么回事？

模板是基因组，目的是克隆一个基因的promoter，片段长度3K，以前克隆的时候能够得到目的条带。但是我最近重提了基因组以后突然就克隆不出来了，换回原来的基因组作为模板得到的条带也是如图所示的。有人考虑到模板或者引物反复冻融次数太多，但是我重新稀释了引物，模板也是分装好的，取了新的，体系和反应条件都没换，结果就是这样。
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1楼 2012-08-10 09:50:29
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09丁于飞

银虫 (初入文坛)
以前遇到过这种情况，结果很出乎意料，是跑胶出了问题，TAE有问题，导致PCR产物跑不出，但是提取的模板和MARKER能够跑出来。不知道你这个会不会是类似问题，或许可以试试。
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2楼2012-08-10 09:54:48
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-10 13:53:49
1，模板浓度太高。
2，引物浓度太高。
3，镁离子浓度太高。
如果确定上述3个没有问题，就只有重提DNA，我以前也遇到过类似现象，重提DNA后就好了，或许DNA质量对你的引物影响太大，或者引物特异性没有那么高或对DNA质量敏感。
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3楼2012-08-10 12:40:24
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linqin1029

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
基本可以确定为模板浓度太高，先将模板进行定量。然后稀释其浓度为50~100ng取1ul进行PCR.再跑电泳看看结果！
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4楼2012-08-10 12:49:01
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的Marker跑的很好，我感觉应该不是胶的问题，可能是引物或模板的问题，这个不太确定
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5楼2012-08-10 12:50:26
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丸子龙

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-12 15:45:23
我和你的情况一模一样，经过分析，是我的上游引物错了。用新合成的上游引物重新pcr出来了正确的目的条带。所以建议你分析引物和模板的序列正确性。
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6楼2012-10-12 15:10:03
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