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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我用EcoRI和XbaI酶双酶切切不下来目的基因
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解瑶123

银虫 (正式写手)

[求助] 我用EcoRI和XbaI酶双酶切切不下来目的基因 已有3人参与

实验室合成了一个新的环形载体4626bp，内含有所需目的基因796bp，该基因上下游两端分别为EcoRI和XbaI酶切位点，但目的基因XbaI酶切位点下游还有一该酶切位点，两位点间隔953bp。我用EcoRI和XbaI酶双酶切切不下来目的基因，然后分别用这两种酶单酶切。琼脂糖电泳得到图（MAKER 为2000），请问该图中的条带怎么解释？（图中从上到下一次为用EcoRI单酶切、用XbaI酶单切、Marker).我还做了很多次双酶切，但都没有成功，这是为什么，我该怎么办？请高手指教切位点
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    • 2013-10-11 12:15:37, 1.25 M

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1楼 2013-10-11 12:15:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-29 18:18:48
这种情况也遇到过。我师弟构建了一个载体，有一个XbaI酶切位点。用另外一个酶单酶切大小正好是载体与插入片段的加和，但是用XbaI就是切不动，后来测序发现确实是连上了，并且XbaI酶切位点序列也是正确的，我们用的宿主是DH5α，希望这些经验对你有帮助~~~
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14楼2013-10-23 10:50:13
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-13 18:01:04
你质粒是从什么e.coli.提取的? 就是DH5alpha或者Xl10b吗?
如果是的话,那基本上应该是XbaI的问题, XbaI会被dam甲基化抑制,你找别的实验室要点dam-dcm-的e.coli.重新转化提取质粒
要么就换个酶,别用XbaI
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2013-10-11 12:56:16
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chun828

铜虫 (初入文坛)
XbaI位点后紧邻的碱基是TC时，即序列为TCTAGA TC时，XbaI 位点的甲基化（Dam甲基化）那么该序列的甲基化将不会被切开！
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阅读经典，成就智慧
17楼2014-11-14 22:48:31
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普通回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把XbaI位点所在的那一段序列发上来，需要看这段序列后帮你判断
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2楼2013-10-11 12:18:06
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
还有哥们你这图下载还扣积分啊
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
4楼2013-10-11 12:57:08
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liying6929

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
解瑶123: 金币+10 2013-10-14 16:01:49
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-10-14 19:02:23
有可能其中一个xbai位点处有甲基化，重转一下去甲基化的感受态试试

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5楼2013-10-11 14:10:22
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tiankong很蓝

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-10-11 12:18:06
把XbaI位点所在的那一段序列发上来，需要看这段序列后帮你判断

gaaaggcttcagacttctgaacccacatcctaagccaaaccccaaaaacaactgatctagacg
AAGGGCAGCTTCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATTCAGGGCGCAAGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAAACGGTGCTGACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGCTATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGA这是含有两个XbaI酶切位点的序列，请帮忙判断。非常感谢
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深呼吸，嘴角上扬，告诉自己：我很好！！！
6楼2013-10-13 16:25:43
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tiankong很蓝

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-10-11 12:56:16
你质粒是从什么e.coli.提取的? 就是DH5alpha或者Xl10b吗?
如果是的话,那基本上应该是XbaI的问题, XbaI会被dam甲基化抑制,你找别的实验室要点dam-dcm-的e.coli.重新转化提取质粒
要么就换个酶,别用XbaI

含目的基因的质粒不是我们实验室合成的，我不知道含该质粒的菌是哪一种，只知道是E.coli Amp/Kan。还有我所需的目的片段两端只有EcoRI和XbaI两酶切位点，我没办法换酶啊。
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深呼吸，嘴角上扬，告诉自己：我很好！！！
7楼2013-10-13 16:41:13
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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解瑶123: 金币+5 2013-10-14 16:02:53
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-10-14 19:01:48
你都不知道你用的质粒到底是什么，那就别用。起码图谱要完全清楚吧！就两个酶切位点的质粒还真没见过。看你图片显示 E酶切正确 Xbal 切出了两条带，说明有两个Xba  这种两个酶切位点 你怎么切下来你的目的基因啊 说不定你双酶切会切出三条片段呢
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8楼2013-10-13 21:25:51
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by tiankong很蓝 at 2013-10-13 16:25:43
gaaaggcttcagacttctgaacccacatcctaagccaaaccccaaaaacaactgatctagacg
AAGGGCAGCTTCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCT ...

XbaI位点被甲基化了，所以肯定是切不开的
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9楼2013-10-14 18:55:05
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tiankong很蓝

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by gyesang at 2013-10-14 18:55:05
XbaI位点被甲基化了，所以肯定是切不开的...

但是含该质粒的菌是非甲基化的
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10楼2013-10-14 21:35:20
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