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解瑶123

银虫 (正式写手)

[求助] 我用EcoRI和XbaI酶双酶切切不下来目的基因 已有3人参与

实验室合成了一个新的环形载体4626bp,内含有所需目的基因796bp,该基因上下游两端分别为EcoRI和XbaI酶切位点,但目的基因XbaI酶切位点下游还有一该酶切位点,两位点间隔953bp。我用EcoRI和XbaI酶双酶切切不下来目的基因,然后分别用这两种酶单酶切。琼脂糖电泳得到图(MAKER 为2000),请问该图中的条带怎么解释?(图中从上到下一次为用EcoRI单酶切、用XbaI酶单切、Marker).我还做了很多次双酶切,但都没有成功,这是为什么,我该怎么办?请高手指教切位点
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tiankong很蓝

银虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by gyesang at 2013-10-14 18:55:05
XbaI位点被甲基化了,所以肯定是切不开的...

但是含该质粒的菌是非甲基化的
深呼吸,嘴角上扬,告诉自己:我很好!!!
10楼2013-10-14 21:35:20
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查看全部 21 个回答

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
把XbaI位点所在的那一段序列发上来,需要看这段序列后帮你判断
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-10-11 12:18:06
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲,勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-13 18:01:04
你质粒是从什么e.coli.提取的? 就是DH5alpha或者Xl10b吗?
如果是的话,那基本上应该是XbaI的问题, XbaI会被dam甲基化抑制,你找别的实验室要点dam-dcm-的e.coli.重新转化提取质粒
要么就换个酶,别用XbaI
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2013-10-11 12:56:16
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲,勿施于人

还有哥们你这图下载还扣积分啊
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
4楼2013-10-11 12:57:08
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