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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于分步双酶切
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策马入林

新虫 (小有名气)

[求助] 关于分步双酶切

我以前用sacI和BamhI直接双酶切效果很好，现在换了酶后感觉效果不太好，想试试个分步酶切，请问具体应该怎么操作，我看两种酶适应的buffer不同，是否在第一次酶切后再回收然后再酶切，还是可以直接加入第二种酶和buffer继续酶切呢
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1楼2012-10-05 12:34:50
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这两个酶可以用同一个buffer切。如果你想用他们各自的buffer做酶切，可以看一下两个buffer成分的区别，如果可以简单的补足的话，中间就不用回收，做好一个酶切后加入不足的成分建立第二种酶切体系。否则，先用一个酶切，纯化回收，再建另一个酶的反应体系。
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2楼2012-10-05 15:55:33
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asdkingstar

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主你现在做的是ARDRA分型么？你之前的双酶切是直接加入两种酶和通用buffer进行没切的吗？具体的加样体系是什么？
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爱是浅浅的喜欢，喜欢是浅浅的爱。
3楼2012-10-06 10:12:59
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策马入林

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-05 15:55:33
这两个酶可以用同一个buffer切。如果你想用他们各自的buffer做酶切，可以看一下两个buffer成分的区别，如果可以简单的补足的话，中间就不用回收，做好一个酶切后加入不足的成分建立第二种酶切体系。否则，先用一个酶 ...

嗯，我以前用的Kbuffer作为共同buffer来切的，效果还是不错的，用的是takara的酶，我看了下neb的酶上标的是这两个酶得分步酶切，不过我也不清楚可靠不。我再仔细研究下他们各自buffer有什么不同吧，先谢过了哈，那个我要是纯化后再做可以使用简单的乙醇沉淀来回收吗
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4楼2012-10-06 14:01:20
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策马入林

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by asdkingstar at 2012-10-06 10:12:59
楼主你现在做的是ARDRA分型么？你之前的双酶切是直接加入两种酶和通用buffer进行没切的吗？具体的加样体系是什么？

不是，我只是将我的含有酶切位点的pcr纯化产物连接进t载体保存，方便后面直接酶切获取目的基因，用于表达
之前酶切一直都是直接加入两种酶和通用buffer进行酶切的
因为要进行目的片段回收所以体系一般用的是：
酶a        0.6
酶b        0.6
kbuffer   1.5
质粒     17
水       10.3
total        30
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5楼2012-10-06 14:05:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
策马入林: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-10-06 20:26:38
引用回帖:
4楼: Originally posted by 策马入林 at 2012-10-06 14:01:20
嗯，我以前用的Kbuffer作为共同buffer来切的，效果还是不错的，用的是takara的酶，我看了下neb的酶上标的是这两个酶得分步酶切，不过我也不清楚可靠不。我再仔细研究下他们各自buffer有什么不同吧，先谢过了哈，那 ...

虽然两种酶的默认最佳buffer不同，但NEB buffer4中这两种酶的活性都是100%，可以用来同时双切。你再看看Takara的各种缓冲液对两个酶的活性。分步切时简单的乙醇沉淀就完全足够的，只要可以除去第一个酶切缓冲体系中的各种成分，能够重建第二个酶切体系就行了。看了下面你建的酶切体系，不知道你是否定量了你的质粒浓度。有时候浓度太高也会影响酶切效果。
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6楼2012-10-06 16:49:55
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asdkingstar

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 策马入林 at 2012-10-06 14:05:07
不是，我只是将我的含有酶切位点的pcr纯化产物连接进t载体保存，方便后面直接酶切获取目的基因，用于表达
之前酶切一直都是直接加入两种酶和通用buffer进行酶切的
因为要进行目的片段回收所以体系一般用的是：
...

这个简单，楼主你看那个说明书上面两种酶切的的温度是否相同？还有说明书后面两种酶在不同buffer中的酶切效率是多少？如果有一种buffer可以使两者酶切效率都大于50%就可以同时酶切，就像你之前那样，最好识大体系。
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爱是浅浅的喜欢，喜欢是浅浅的爱。
7楼2012-10-07 19:04:07
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策马入林

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by asdkingstar at 2012-10-07 19:04:07
这个简单，楼主你看那个说明书上面两种酶切的的温度是否相同？还有说明书后面两种酶在不同buffer中的酶切效率是多少？如果有一种buffer可以使两者酶切效率都大于50%就可以同时酶切，就像你之前那样，最好识大体系。...

呵呵，谢谢哦，我试试去
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8楼2012-10-08 10:34:33
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