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酶切专家

金虫 (小有名气)

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[求助] 关于EcoRI的部分酶切

我准备用EcoRI+XbaI在我的质粒上克隆外源基因，但酶切验证时发现在质粒上有两个EcoRI位点，所以不得不进行部分酶切。
我的计划是：先用XbaI进行完全酶切，然后加少量EcoRI，进行部分酶切（希望出现只在一个EcoRI位点切开的条带），然后回收在我希望的位点切开的那条带，进行克隆。
我已经尝试了一次，发现即使只酶切5分钟，质粒上的两个EcoRI都全切开了。大家有相关经验吗？

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1楼2012-03-17 16:51:50

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panda73

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 听起来好难…… 2012-03-18 17:50:09
酶切专家: 回帖置顶 2012-03-19 20:47:18
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 根据楼主反馈，切实可行，授予EPI！ 2012-03-20 11:44:26

我以前做过类似的部分酶切实验：
我得经验如下：
首先必须精确计算所需的酶量。我曾经在小木虫推荐过一个软件（Ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｄｅｓｉｇｎｅｒ），你可以利用该软件精确计算出ＥｃｏＲＩ的用量，然后将其理论用量减少１／２或２／３，将酶切时间缩短到５分钟，应该没问题。。（注意，酶一定先稀释１０倍以上，然后从稀释的酶样品中取出所需的酶量，否则，由于原酶中含５０％甘油，误差太大，肯定效果不好）。
如果这种克隆都能成功，你可以藐视大部分的分子克隆工作。
祝一切顺利。

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10楼2012-03-18 15:23:09

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★
酶切专家: 回帖置顶 2012-03-19 21:11:56
西瓜: 金币+1, 恭喜恭喜~期待楼主结果哈~ 2012-03-20 11:42:50

引用回帖:

10楼: Originally posted by panda73 at 2012-03-18 15:23:09:
我以前做过类似的部分酶切实验：
我得经验如下：
首先必须精确计算所需的酶量。我曾经在小木虫推荐过一个软件（Ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｄｅｓｉｇｎｅｒ），你可以利用该软件精确计算出ＥｃｏＲＩ的 ...

我按照此建议，利用double digestion designer计算的酶量的1/2，切了5分钟，然后加SDS终止反应，电泳检测，发现的确是部分酶切，已经成功回收到预期的目的条带。
非常感谢！
随后会汇报克隆结果。
如果成功，就节省了我好几天时间。

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13楼2012-03-19 20:51:42

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