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酶切专家金虫 (小有名气)
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关于EcoRI的部分酶切
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我准备用EcoRI+XbaI在我的质粒上克隆外源基因，但酶切验证时发现在质粒上有两个EcoRI位点，所以不得不进行部分酶切。 我的计划是：先用XbaI进行完全酶切，然后加少量EcoRI，进行部分酶切（希望出现只在一个EcoRI位点切开的条带），然后回收在我希望的位点切开的那条带，进行克隆。 我已经尝试了一次，发现即使只酶切5分钟，质粒上的两个EcoRI都全切开了。大家有相关经验吗？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
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西瓜: 金币+2, 听起来好难…… 2012-03-18 17:50:09
酶切专家: 回帖置顶 2012-03-19 20:47:18
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 根据楼主反馈，切实可行，授予EPI！ 2012-03-20 11:44:26
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西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 根据楼主反馈，切实可行，授予EPI！ 2012-03-20 11:44:26
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我以前做过类似的部分酶切实验： 我得经验如下： 首先必须精确计算所需的酶量。我曾经在小木虫推荐过一个软件（Ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｄｅｓｉｇｎｅｒ），你可以利用该软件精确计算出ＥｃｏＲＩ的用量，然后将其理论用量减少１／２或２／３，将酶切时间缩短到５分钟，应该没问题。。（注意，酶一定先稀释１０倍以上，然后从稀释的酶样品中取出所需的酶量，否则，由于原酶中含５０％甘油，误差太大，肯定效果不好）。 如果这种克隆都能成功，你可以藐视大部分的分子克隆工作。 祝一切顺利。 |
10楼2012-03-18 15:23:09
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