应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于EcoRI的部分酶切
51/1返回列表
查看: 3061  |  回复: 15
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)

[求助] 关于EcoRI的部分酶切

我准备用EcoRI+XbaI在我的质粒上克隆外源基因，但酶切验证时发现在质粒上有两个EcoRI位点，所以不得不进行部分酶切。
我的计划是：先用XbaI进行完全酶切，然后加少量EcoRI，进行部分酶切（希望出现只在一个EcoRI位点切开的条带），然后回收在我希望的位点切开的那条带，进行克隆。
我已经尝试了一次，发现即使只酶切5分钟，质粒上的两个EcoRI都全切开了。大家有相关经验吗？
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2012-03-17 16:51:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 听起来好难…… 2012-03-18 17:50:09
酶切专家: 回帖置顶 2012-03-19 20:47:18
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 根据楼主反馈，切实可行，授予EPI！ 2012-03-20 11:44:26
我以前做过类似的部分酶切实验：
我得经验如下：
首先必须精确计算所需的酶量。我曾经在小木虫推荐过一个软件（Ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｄｅｓｉｇｎｅｒ），你可以利用该软件精确计算出ＥｃｏＲＩ的用量，然后将其理论用量减少１／２或２／３，将酶切时间缩短到５分钟，应该没问题。。（注意，酶一定先稀释１０倍以上，然后从稀释的酶样品中取出所需的酶量，否则，由于原酶中含５０％甘油，误差太大，肯定效果不好）。
如果这种克隆都能成功，你可以藐视大部分的分子克隆工作。
祝一切顺利。
赞一下 回复此楼
10楼2012-03-18 15:23:09
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答

blastfeng

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最好是甲基化处理，这个也不能保证每一个位点甲基化，只能试试，跑胶，看看酶切程度，再回首，估计工作量很大啊
赞一下 回复此楼
生活就像PCR
2楼2012-03-17 19:11:18
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

a731705125

银虫 (小有名气)
可不可以把质粒突变一下，用pcr的方法把其中一个酶切位点突变掉
赞一下 回复此楼
3楼2012-03-17 20:40:19
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah_lz

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 第一次听说，学习了~ 2012-03-18 17:48:07
EcoRI 活性非常高，基本上酶切鉴定质粒的话，37度五分钟和一个小时的区别不大，所以建议换成别的酶切位点，免得浪费更多时间
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2012-03-17 21:42:35
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭