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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】Sau3AI 部分酶切
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芥末蚕豆

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】Sau3AI 部分酶切 已有4人参与

我想用Sau3AI 部分酶切，获得23kb-15kb的片段，但是每次酶切后，片段都比较弥散，从23kb到最小都有（本身总DNA就有一定的涂带）。调整酶切条件也没有得到单纯的23kb-15kb片段，不知道有没有做过这方面的，可以给我提供一些酶切的经验。谢谢了！
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开心就好！
1楼 2010-12-01 21:34:36
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scelab

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dhd997(金币+1):good 2010-12-02 08:07:58
正常，切胶回收的时候在理论大小附近1~2mm切就好，
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小木虫之有关部门负责人
2楼2010-12-01 23:11:29
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王家大成

木虫 (正式写手)

囧囧小虫
割胶回收就好了
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一念起，万水千山；一念灭，沧海桑田！
3楼2010-12-02 01:02:36
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brightfuture01

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dhd997(金币+2):谢谢交流 2010-12-02 08:08:10
Sau3AI 是四碱基识别内切酶，所以理论上256bp就有一个酶切位点。部分酶切的时候酶量及酶切时间要优化。我倒是优化过，但是我最后想拿的是3-10kb的片段。

不知道你提取的是环境样品的还是什么物种的DNA，如果是环境样品的，本身提取出来也就是23kb左右。

跑个低浓度过夜的胶，然后电洗脱回收，不要胶回收。即便是Qiagen的理论上能回收40kb的试剂盒，回收效果也是极其不理想。

有条件的话最好能用脉冲场电泳来跑胶。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2010-12-02 02:56:15
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芥末蚕豆

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-02 02:56:15:
Sau3AI 是四碱基识别内切酶，所以理论上256bp就有一个酶切位点。部分酶切的时候酶量及酶切时间要优化。我倒是优化过，但是我最后想拿的是3-10kb的片段。

不知道你提取的是环境样品的还是什么物种的DNA，如果是 ...

我提的是链霉菌的总DNA,虽说提取出来的是23kb，但肯定比这个是要大一点，肯定是要切一下才能连接。我想问，你当时优化条件是怎么做的啊？我们实验室可能没有你说的回收条件，老师倒是说可以给我买试剂盒，但是大片段的试剂盒效果也不是很好，我怕买回来效果也不是很好！
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5楼2010-12-02 11:41:55
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brightfuture01

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dhd997(金币+2):good 2010-12-02 12:38:33
怎么会没有我说的回收条件呢？买段透析袋，在电泳槽里就可以了，虽然没有办法低温。优化的时候要准备充足的DNA，保证每次的起始DNA量都是一样的，然后做一系列梯度的酶和酶切时间。然后跑电泳看看哪个酶切后条带集中在15-23kb左右。优化好了之后，正式试验的时候就按照这个体系来。

[ Last edited by brightfuture01 on 2010-12-2 at 12:27 ]
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6楼2010-12-02 12:25:59
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芥末蚕豆

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-02 12:25:59:
怎么会没有我说的回收条件呢？买段透析袋，在电泳槽里就可以了，虽然没有办法低温。优化的时候要准备充足的DNA，保证每次的起始DNA量都是一样的，然后做一系列梯度的酶和酶切时间。然后跑电泳看看哪个酶切后条带集 ...

谢谢解答了！老师说透析袋回收率也很低，不知道从哪给我弄了点低熔点琼脂糖，但是那个琼脂糖我浓度配到1.2%了，也还是不凝固?不知道为什么？
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7楼2010-12-07 15:49:37
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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呵呵，纯菌的回收率低就低点呗，提个细菌总DNA还不很容易么。低熔点胶是进口的么？应该能凝的啊，不行就放在4度试试看能凝么。

低熔点胶倒是比较好用，完了切下来的胶稍微加热一下就融了，用琼脂糖酶消化的时候也很容易。

想问问你接下来是要连粘粒，作文库么？

[ Last edited by brightfuture01 on 2010-12-7 at 15:56 ]
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8楼2010-12-07 15:53:52
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芥末蚕豆

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-07 15:53:52:
呵呵，纯菌的回收率低就低点呗，提个细菌总DNA还不很容易么。低熔点胶是进口的么？应该能凝的啊，不行就放在4度试试看能凝么。

低熔点胶倒是比较好用，完了切下来的胶稍微加热一下就融了，用琼脂糖酶消化的时候 ...

不知道老师从哪整的，一小瓶，连个标签也没有！是，之后要连接一下，然后转一下，做表达！不做文库！
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9楼2010-12-07 16:50:46
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